Métodos de determinação

Conforme será apresentado a seguir, vários métodos, como o microbiológico de difusão em agar, CLAE, espectrofotometria, CCD, entre outros, têm sido descritos para a determinação de AZ em matérias-primas e formulações farmacêuticas.

A Farmacopéia Americana (USP 29, 2006) disponibiliza monografias para AZ como matéria-prima, na forma de cápsulas e suspensão oral. O método descrito nesta farmacopéia, para quantificação e estudos de dissolução de cápsulas, é a CLAE, que indica a utilização de fase móvel com pH elevado (pH = 11), coluna cromatográfica específica (gama-alumina) e detector eletroquímico. O teste de dissolução preconizado indica: a) meio de dissolução: solução tampão de fosfato de sódio pH 6,0, contendo 0,1 % de tripsina (900 ml); b) aparato: pá, 100 rpm; c) tempo de coleta: 45 minutos, d) liberação mínima de 75 % e e) temperatura: 37 °C ± 0,5 °C.

Na Farmacopéia Brasileira IV (2003) encontram-se disponíveis monografias para matéria-prima e cápsulas. O método de determinação da potência de AZ é o microbiológico de difusão em ágar, utilizando Microcroccus luteus ATCC 9341 como microrganismo teste. O

teste de dissolução não se encontra descrito nessa farmacopéia. Para comprimidos não foram encontradas monografias oficiais.

A avaliação da potência de AZ em formas farmacêuticas pelo método de difusão em ágar tem sido proposta por alguns autores. Turcinov e Pepeljnjak (1998) determinaram a potência de AZ através do método microbiológico utilizando o modelo quadrado latino 8 x 8, com duas concentrações da solução padrão e duas da amostra, e testando a sensibilidade de AZ frente a vários microrganismos. O método apresentado por Breier et al. (2002) utilizou

Microcroccus luteus ATCC 9341 como microrganismo teste para avaliar a potência de AZ em

cápsulas e suspensão oral, demonstrando linearidade, exatidão e precisão. Salgado e Roncari (2005) desenvolveram método microbiológico por difusão em ágar para a determinação de AZ em soluções oftálmicas. A concentração de trabalho foi de 1,66 mg/ml de AZ e o microrganismo utilizado foi Bacillus subtilis ATCC 9372. O método demonstrou linearidade, precisão e exatidão.

Gandhi et al. (2000) desenvolveram e validaram método por CLAE para quantificação e estudo de dissolução de comprimidos e cápsulas contendo AZ. Os autores utilizaram coluna C18, fase móvel constituída de acetato de amônia, acetonitrila: metanol e tetraidrofurano

(60:27:25:2,5, V/V), com vazão de 1 ml/min e detector eletroquímico. Os estudos de dissolução de três produtos comerciais foram realizados, conforme monografia para AZ cápsulas da USP 23, utilizando tampão fosfato de sódio pH 6,0 como meio de dissolução, sistema de pá e rotação de 100 rpm. Amostras (n=3) de cada produto foram coletadas em 5, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos e avaliadas. O método demonstrou ser simples, exato e preciso para o objetivo proposto.

Zubata et al. (2002) desenvolveram método por CLAE mais simples e com equipamentos mais acessíveis, utilizando coluna C18 e fase móvel constituída de tampão

fosfato de amônio: acetonitrila e metanol (60:20:20, V/V/V), com pH ajustado para 8,0 com ácido fosfórico e detecção no ultravioleta, em 215 nm. Segundo os autores, o método pode ser aplicado para análise de teor e testes de dissolução. Os dados referentes à dissolução não foram, no entanto, apresentados no referido trabalho.

A CLAE com detecção no ultravioleta a 210 nm foi aplicada por Miguel e Barbas (2003) para determinação de impurezas em AZ comprimidos. O método desenvolvido utilizou duas fases móveis. A fase A era constituída de tampão fosfato de potássio, pH 7,0, e a fase B era constituída de uma mistura de acetonitrila: metanol (1:1, V/V). A eluição por gradiente foi realizada a uma vazão de 1 ml/min. Foi utilizada coluna C4, mantida a 50 °C. O método

Debremaeker et al. (2003) desenvolveram método por CLAE acoplado à espectrometria de massa. O método foi aplicado para avaliação da pureza de matéria-prima de AZ, e apresentou algumas vantagens quando comparado aos métodos já descritos por CLAE com detecção no UV, como a possibilidade de detecção de novas substâncias, com ganho de tempo por não necessitar de isolamento e purificação das substâncias analisadas.

Li (2006) desenvolveu método por CLAE para a determinação de AZ cloridrato e substâncias relacionadas, em matérias-primas, utilizando coluna C18, mantida à temperatura

de 40 ºC e fase móvel contendo tampão fosfato de amônio (pH ajustado para 6,5 com trietilamina) e acetonitrila (70:30, V/V). A vazão foi de 1 ml/min. e detecção no UV à 215 nm. O método demonstrou ser rápido, simples e sensível.

Um método espectrofluorimétrico foi desenvolvido por Khashaba (2002) para análise de antibióticos macrolídeos, como a AZ, em formas farmacêuticas. O método demonstrou linearidade, exatidão, precisão, robustez e aplicabilidade em formulações farmacêuticas. Também não foram detectadas interferências de excipientes, além de ser mais simples e econômico do que os métodos descritos anteriormente.

A determinação de AZ em formas farmacêuticas foi realizada por Nigovic e Simunic (2003) através da voltametria em sistema cíclico, linear e pulso diferencial, utilizando eletrodo de carbono. O método apresentou resultados comparáveis aos obtidos pelo método oficial. Farghaly e Mohamed (2004) também desenvolveram método por voltametria em onda quadrada equipado com eletrodo de carbono. O método demonstrou ser comparável aos já descritos por CLAE, podendo ser utilizado para análise de AZ em matérias-prima, em preparações farmacêuticas e em fluídos biológicos.

Foi desenvolvido, por Komorsky-Lovric e Nogovic (2004), método para identificação de AZ, ciprofloxacino e ácido 5-aminosalicílico através da voltametria equipada com eletrodo de grafite, na forma cíclica e onda quadrada. Os autores propuseram o método para determinação qualitativa, destes fármacos, em preparações farmacêuticas.

Song e Wang (2003) desenvolveram método baseado na reação de quimioluminescência usando luminol e peróxido de hidrogênio. Este método demonstrou ser econômico, eficiente, sensível e seletivo para AZ em preparações farmacêuticas e em fluidos biológicos.

Khedr e Sheha (2003) propuseram método por cromatografia em camada delgada para a análise de AZ em cápsulas e matéria-prima. Nesta metodologia foram utilizadas placas de sílica-gel e fase móvel constituída de hexano-acetato de etila-dietilamina (75:25:10, V/V/V). O referido método mostrou seletividade, sensibilidade, exatidão, precisão, linearidade e

robustez satisfatórias. Os autores sugeriram que o mesmo pode ser utilizado para a determinação de impurezas de cápsulas e matéria-prima, uniformidade de conteúdo, teste de dissolução e estabilidade de cápsulas.

Danielson et al. (1993) apresentaram método simples de identificação qualitativa e quantitativa de antibióticos macrolídeos por espectrofotometria no visível, em 420 nm, através da reação com ácido sulfúrico concentrado. O método foi desenvolvido para análise de eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, espiramicina e tilosina, e o mesmo demonstrou ser aplicável para formulações e matérias-primas.

Gallagher e Danielson (1995) desenvolveram método espectrofotométrico para a determinação de eritromicina, oleandomicina, espiromicina e tilosina em formulações farmacêuticas, através de reações com íon férrico (Fe 3+) na presença de mistura de ácido acético e ácido sulfúrico. A reação produziu coloração a qual pode ser detectada a 592 nm.

Um sistema rápido de identificação de antibióticos macrolídeos, incluindo a AZ, foi desenvolvido por Hu et al. (2006), como ferramenta de investigação de produtos falsificados. O método foi baseado na reação entre ácidos concentrados e as substâncias em análise, produzindo colorações que permitem a detecção e diferenciação dos antibióticos macrolídeos presentes nas matérias primas e preparações farmacêuticas.

A determinação espectrofotométrica de seis fármacos contendo grupos doadores de elétrons foi apresentada por Kelani et al. (1997). Foram testados azitromicina, cetoconazol, clotrimazol, clozapina, oxamniquine e pimozida. O método foi baseado na formação de produto da reação entre 2,3 – dicloro – 5,6 – diciano – p – benzoquinona (DDQ) e os fármacos contendo os grupos doadores de elétrons, possibilitando leituras em 588 nm. O método demonstrou ser aplicável para a determinação destas substâncias em matérias-primas e formas farmacêuticas.

Li et al. (2004) realizaram a determinação de AZ por espectrofotometria baseados na reação de transferência de carga entre o fármaco, como doador, e vermelho de alizarina, como receptor, em solução etanólica. A absorbância do complexo formado foi mensurada em 546 nm. O método demonstrou ser aplicável para a determinação de AZ em formas farmacêuticas.

Tian et al. (2005) validaram método espectrofotométrico para a determinação de azitromicina no teste de dissolução de comprimidos, também baseado na formação de complexo entre a AZ e o vermelho de alizarina, com leitura em 538 nm. As condições do teste de dissolução foram 900 ml meio tampão fosfato de sódio (pH 6,0), a 100 rpm, tempo de coleta de 45 minutos, com tolerância de liberação mínima de 75 % da quantidade declarada de

AZ. O método demonstrou linearidade e aplicabilidade no teste de dissolução de comprimidos.

Huang et al. (2006) desenvolveram método espectrofotométrico através da interação de azitromicina com 7,7,8,8 – tetracianoquinodimetano (TCNQ) e com ácido cloranílico (CL). As absorbâncias foram determinadas em 743 nm para o complexo com TCNQ e em 842 nm para o complexo com CL. Ambos os métodos demonstraram aplicabilidade para a determinação de azitromicina em comprimidos.

Rachidi et al. (2006) realizaram a determinação de azitromicina por espectrofotometria através da formação de pares iônicos entre o fármaco e o complexo inorgânico de tiocianato seguido da extração com dicloroetano. O complexo formado apresentou coloração alaranjada com máximo de absorbância em 469 nm. As condições da reação foram estudadas e otimizadas e o método demonstrou ser simples e aplicável para a determinação de azitromicina em formulações farmacêuticas e para o teste de dissolução de comprimidos.

Entre os métodos para avaliar AZ em fluídos biológicos encontram-se CLAE com detecção amperométrica (SHEPARD et al., 1990; TANINAKA et al., 1999; MANDIC et al., 2003), CLAE com detecção por fluorescência (TORANO e GUCHELAAR, 1998; WILMS et al., 2004; BAHRAMI et al., 2005), CLAE acoplado à espectrometria de massa (NIROGI et al., 2005) e voltametria (KIM et al., 2005). A comparação entre métodos por CLAE e microbiológico para a determinação de azitromicina foram apresentados em estudos clínicos por Riedel et al. (1992). Estudos para a determinação de AZ em águas da rede pública de alguns municípios norte americanos foram realizados através da CLAE acoplada à espectrometria de massas (KOCH et al., 2005).