Para determinação do pH, alcalinidade e da turbidez foram adotados os protocolos de análise descritos no Standard Methods (APHA, AWWA e WEF, 1998). Para quantificação de coliformes totais e Escherichia coli, foi utilizado o método do substrato cromogênico ONPG-MUG, utilizando o sistema patenteado Colilert. Para determinação de clorofila-a, foi adotado o procedimento descrito no trabalho de Lloyd e Tucker (1988). Os princípios desses métodos e os equipamentos necessários estão resumidos na Tabela 4.5.
Tabela 4.5 - Métodos de análise adotados
Parâmetro Método para análise Equipamento
Turbidez Nefelométrico Turbidímetro
(HACH/2100AN)
pH Potenciométrico
Alcalinidade Titulométrico com EDTA
Clorofila-a
Extração em clorofórmio- metanol com medida de absorbância em λ=665 e
λ=750
Espectrofotômetro (HACH/DR-4000)
Coliformes totais e E. coli Substrato cromogênico ONPG-MUG
Seladora para cartelas do colilert® e estufa Fanem
Microcistina Imunoensaio
ELISA - Envirologix® Espectofotômetro BIO-RAD
550
Para a quantificação das frações intra e extracelular de microcistina em uma amostra, é preciso inicialmente que o volume seja filtrado em filtro de microfibra para que a fração intracelular fique retida no filtro, e que a fração extracelular permaneça na água filtrada. O
filtro de microfibra contendo a fração intracelular passa por um procedimento para extração da microcistina descrito por Krishnamurthy et al. (1986), descrito no Apêndice C e pelo processo de purificação da amostra descrito por Tsuji et al. (2004), descrito no Apêndice D.
Uma outra metodologia para quantificação de microcistina intracelular e calcular da diferença entre a microcistina total e a extracelular, descrita no Apêndice B.
Para a quantificação de microcistina extracelular no volume filtrado, a amostra é lida diretamente pelo método ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Esse método foi selecionado por ser reconhecido como um método confiável de detecção de microcistina, de boa reprodutibilidade e de baixo limite de detecção (0,16 μg/L), além de ser de relativamente fácil execução (Harada et al., 1999). No mercado existem vários tipos de kits ELISA, como por exemplo, os qualitativos, onde a leitura pode ser feita visualmente, e os quantitativos, que são feitos em placas, necessitando de um espectofotômetro específico para leitura da placa. Nesse trabalho estão sendo utilizados
kits ELISA quantitativos, produzidos pela Envirologix®, que é comercializado no Brasil e
consiste de uma placa com 96 poços e os reagentes necessários para a execução da análise. O intervalo de detecção desse kit está entre 0,16ppb e 2,5ppb, então, para a análise de amostras que contenham mais microcistina que o limite superior fez-se necessário realizar diluições (ver Apêndice E). Para que seja realizada a leitura da densidade ótica, a placa é introduzida numa leitora ótica de ELISA, que fornece uma leitura medida em 450 nm.
4.4 – CULTIVO
4.4.1 – Implantação do cultivo de cianobactérias
Como já mencionado no item 3.1, as cianobactérias se desenvolvem melhor sob certas condições de temperatura, luminosidade, pH e nutrientes, dessa forma, para a obtenção de um cultivo desses microrganismos, condições ótimas foram buscadas. As condições ótimas para um crescimento saudável das células de cianobactérias dependem de sua espécie ou até mesmo de sua cepa.
Tendo em vista que não havia pessoal com experiência nesse tipo de cultivo na Universidade de Brasília, buscou-se o apoio do Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ, onde há um banco de cultivo desenvolvido e os protocolos de cultivo já foram testados.
De acordo com as orientações do LETC, uma sala de cultivo de cianobactérias foi instalada no Laboratório de Análises de Água (LAA), no prédio SG-12, na Universidade de Brasília.
Para dar início ao cultivo de cianobactérias, cepas específicas foram fornecidas pelo LETC. Foram enviadas três diferentes cepas:
- Microcystis aeruginosa, cepa NPLJ-4 (tóxica). - Cylindrospermopsis racisborskii, cepa T3 (tóxica).
- Cylindrospermopsis racisborskii, cepa NPLP-1 (não tóxica).
É válido salientar que o cultivo é monoespecífico, ou seja, o cultivo de cada uma das cepas é feito separadamente.
O cultivo de interesse para o presente trabalho é de células de Microcystis aeruginosa. As células da espécie Cylindrospermopsis racisborskii não foram utilizadas nesse trabalho, porém foram cultivadas para uso em outros trabalhos de pesquisa.
4.4.2 – Características e desenvolvimento do cultivo de Microcystis aeruginosa
Segundo Oliveira (2003), a cepa NPLJ-4 da espécie M. aeruginosa, isolada da Lagoa de Jacarepaguá, na cidade do Rio de Janeiro, produz quatro tipos de microcistinas, das quais 80% da concentração total correspondem a microcistina-LR. No LAA essa cepa está sendo cultivada em meio ASM-1 (Gorham et al.,1964 apud Gibson e Smith, 1982) sob intensidade luminosa de aproximadamente 55 µE.m-2.s-1, temperatura de 24+1oC, pH entre 7 e 8 e foto-período de 12 horas.
As células da cepa NPLJ-4 ao atingirem a fase exponencial de crescimento (15-18 dias de cultivo) precisam receber um meio de cultura novo, ou seja, mais nutrientes. Nesse
momento ocorre a repicagem do cultivo, o que leva à produção de volumes maiores de cultivo. Isso porque para manter as células sadias e reproduzindo, utiliza-se a proporção de 1:9, sendo uma parte de células que atingiram o crescimento exponencial, e nove partes de meio de cultura novo. O meio ASM-1 é composto apenas por substâncias inorgânicas e está descrito no Apêndice F. Uma curva de crescimento dessa cepa é apresentada na Figura 4.4, e pode-se verificar que se trata de um crescimento característico ao das bactérias. Já a Figura 4.5 apresenta a diferença de coloração entre o cultivo com 15 dias e outro com 5 dias.
Figura 4.4 – Comportamento do crescimento das células cultivadas de Microcystis
aeruginosa.
Figura 4.5 – Diferença de coloração entre os cultivos de células com 15 dias (a) e com 5 dias (b).
Periodicamente foi retirada uma amostra do cultivo para observação no microscópio. Esse procedimento é importante para a verificação do aspecto das células e também para acompanhamento de sua concentração. Para a contagem de cianobactérias foi utilizada a
0,0E+00 2,0E+06 4,0E+06 6,0E+06 8,0E+06 1,0E+07 1,2E+07 1,4E+07 1,6E+07 1,8E+07 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo de cultivo (dias)
Concentração de
M.
aeruginosa
(μg/L)
câmara de Neubauer, pois é reticulada, o que facilita a contagem, e tem a vantagem de necessitar de uma quantidade muito pequena de amostra (100μL).
A Figura 4.6 apresenta o aspecto das células cultivadas. Como pode ser observado, a espécie de cianobactéria Microcystis aeruginosa possui cor verde intenso e apresenta uma nata na superfície do líquido, característica de florações dessa espécie.
Figura 4.6 – Aspecto das células cultivadas (a) e presença de uma nata sobrenadante (b).
Como apresentado no item 4.2, os experimentos de filtração contemplam fases em que o filtro foi alimentado com água bruta contendo células viáveis de Microcystis aeruginosa e fases em que o filtro foi alimentado com água bruta contendo microcistina extracelular. No primeiro caso utilizou-se diretamente o cultivo em fase exponencial de crescimento celular com a diluição necessária para atingir-se a concentração de células desejada na água bruta. As células que estão em fase exponencial permanecem com suas características inalteradas se forem mantidas refrigeradas por poucos dias. Em períodos longos de armazenamento, as células começam a morrer e a liberar a microcistina para o meio líquido.
No segundo caso, para a obtenção de microcistina extracelular a partir das células cultivadas de M. aeruginosa, se faz um procedimento de gelo/degelo do cultivo por três vezes consecutivas. Esse procedimento promove o rompimento da membrana celular e a microcistina, juntamente com os demais compostos intracelulares, é liberada para o meio líquido. Em seguida, todo esse material composto por membranas celulares rompidas,
compostos intracelulares dissolvidos e meio ASM1 é centrifugado por 10 minutos a 3000rpm para que todo o material particulado sedimente. O líquido sobrenadante é filtrado em filtro de abertura 1,0 μm como mais uma etapa de purificação, dessa forma será obtida uma solução concentrada de microcistina e dos demais compostos intracelulares.