Métodos de identificação do HP

Os métodos inicialmente utilizados para a detecção do HPV foram a hibridização direta com sondas como o Southern e Dot blot. No entanto, além de serem muito trabalhosos, consumem um tempo muito prolongado, apresentam sensibilidade baixa e requerem quantidades altas de DNA. Estas técnicas têm sido gradualmente substituídas pela tecnologia da PCR (amplificação do alvo), que

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permite a detecção de um número pequeno de cópias virais em cada amostra (GARLAND; TABRIZI, 2006).

A PCR é um experimento capaz de amplificar de modo exponencial e reprodutível a seqüências de HPV presentes nas amostras de DNA. Geralmente a sensibilidade varia de 1 a 10 cópias por reação de PCR, e é alcançada pela maioria dos métodos utilizados (GARLAND; TABRIZI, 2006).

A maioria dos experimentos utiliza primers denominados “consensus” ou universais que amplificam a parte mais conservada do genoma do HPV, a região L1, permitindo a detecção de um grande número de HPVs em uma reação. Diversos pares de primers consensus são descritos na literatura como GP5/GP6 e o GP5+/GP6+ modificado, MY09/MY11 e PGMY09/11 e o SPF (DE RODA HUSMAN et al., 1995; JACOBS et al., 1995; KLETER et al., 1998; GARLAND; TABRIZI, 2006; ATALAY et al., 2007). Além dos primers pI-1 e pI-2, que são similares ao MY (HUSNJAK et al., 2000). Os pares de primers L1C1 e L1C2, também localizados na região L1, são capazes de detectar pelo menos 9 tipos de HPVs com grande eficiência (HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 52 e 58) e outros 2 tipos HPV-34 e 36, menos eficientemente (YOSHIKAWA et al., 1991).

Há vários primers situados na região L1, sejam degenerados (MY) ou consensus (GP). O sistema SPF emprega uma mistura de primers definidos para as regiões-alvo SPF1 e SPF2, que estão localizadas dentro das regiões dos primers MY e GP (KLETER et al., 1998). A amplificação com cada um destes pares de

primers resulta em diferentes produtos de amplificação (Figura 2), variando a

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Figura 2 – Desenho esquemático representando os pares de primers MY, GP e SPF, na região L1 do genoma do HPV

Os sistemas MY09/MY11 e GP5+/GP6+ são os mais freqüentemente utilizados e avaliados clinicamente (VAN DEN BRULE et al., 2002).

Os primers MY09/MY11, PGMY09/11, GP5+/GP6+ e SPF10 são capazes de amplificar pelo menos 18 tipos de HPV, os mais comumente associados a neoplasias cervicais (HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 e 83) (KREIMER et al., 2005).

Durante a integração do genoma do HPV ao hospedeiro humano partes da região L1 podem estar deletadas e os primers consensus, que não se localizam nesta região são preferidos, como os da região E6. Em comparação com os primers E6, os primers da região L1 tem maior espectro de detecção dos HPVs (HUSNJAK et al., 2000).

GP5 e GP6 são complementares à região L1 localizados dentro da seqüência reconhecida pelo MY. Podem ser utilizados sozinhos ou em conjunto com MY em

nested PCR. A utilização de nested PCR para a detecção do HPV empregando os primers MY e GP são amplamente descritas na literatura (EVANDER et al., 1992;

HUSNJAK et al., 2000), principalmente em lesões orais (SMITH et al. 2004b; GIOVANNELLI et al., 2006). Desta forma aumenta-se a eficiência de detecção do HPV provavelmente pelo produto de amplificação ser menor (~150bp) além de o GP não conter bases degeneradas como no MY (HUSNJAK et al., 2000).

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Os primers GP5+/GP6+ apresentam uma sensibilidade menor do que o par de primers SPF, principalmente nos casos de citologia normal, em pacientes sem lesões cervicais (KLETER et al., 1999).

Atualmente as duas metodologias mais amplamente utilizadas para a detecção do HPV são o Hybrid Capture 2™ e a PCR com primers consensus. Ambos os testes apresentam sensibilidade e especificidade equivalentes, factíveis em estudos epidemiológicos e clínicos com grande número de pacientes (IARC, 2007).

O sistema SPF10-LiPA apresenta uma grande concordância no diagnóstico de HPVs de alto risco com o sistema Hybrid Capture 2™. No entanto, este último é o único aprovado pela FDA (Food and Drug Administration). O sistema Hybrid Capture 2™ utiliza um coquetel de sondas de alto e baixo risco, mas não permite a tipagem e a diferenciação de infecções múltiplas ou únicas pelo HPV (SAFAEIAN et al., 2007).

Geralmente, os sistemas de PCR permitem a detecção de vários tipos do HPV já que os primers fazem o anelamento em uma região altamente homóloga de vários genótipos. Ultimamente percebe-se uma crescente necessidade em identificar os genótipos específicos do HPV a fim de esclarecer aspectos epidemiológicos e o comportamento clínico de tipos virais particulares. Além do mais, a tipagem do HPV é de grande importância na caracterização de estudos populacionais envolvendo a avaliação e o monitoramento da eficiência das vacinas contra o vírus (VAN DEN BRULE et al., 2002).

A tipagem do HPV pode ser realizada a partir do par de primers MY09/MY11 e um sistema line blot que também realiza a co-amplificação de um gene de controle interno, beta globina. Este teste, comercializado pela Roche Diagnostics, permite a tipagem de 27 genótipos do HPV (VERNON; UNGER; WILLIAMS, 2000).

Outro sistema disponível para a tipagem do HPV é o INNO LiPA (Innogenetics®, Gent, Bélgica). Este sistema utiliza os primers SPF que são capazes de amplificar um amplo espectro de genótipos de HPV, pelo menos 43 tipos. A associação deste par de primers com o sistema de hibridização reversa com sondas (LiPA) permite a detecção de diferentes genótipos de HPV mesmo que um tipo esteja presente em quantidade 1000 vezes maior do que o outro (KLETER et al., 1999). O pequeno produto de amplificação dos primers SPF confere uma sensibilidade analítica maior, mas possivelmente menor especificidade para a

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detecção do HPV (SAFAEIAN et al., 2007). A capacidade de detecção de diferentes alvos de cada par de primers é limitada, e portanto a utilização de uma mistura de primers, como o sistema SPF10 pode ser mais eficaz que os primers consensus. O ponto de ínicio de um primer (3’) é crucial na eficiência da PCR, no alinhamento da seqüência, e os primers SPF1 e SPF2 estão em uma região altamente conservada de todos os genótipos dos HPVs (KLETER et al., 1998).

A determinação do genótipo do HPV após a utilização de consensus primers pode ser realizada através do seqüenciamento de nucleotídeos, sondas oligonucleotídeas, hibridização (Southern dot blotting), ensaios imunoenzimáticos (EIA) dos produtos de PCR ou pela PCR com primers específicos (YOSHIKAWA et al., 1991; GILLIO-TOS et al., 2006; VAN DEN BRULE et al., 2002). No entanto, alguns destes métodos são muito trabalhosos (VAN DEN BRULE et al., 2002). Métodos de hibridização reversa utilizando evidenciação não radioativa, colororimétrica com substratos foram propostos mais recentemene para a tipificação do HPV (GRAVITT et al., 1998; KLETER et al., 1998; VAN DEN BRULE et al., 2002). Estes testes utilizam tiras individuais de hibridização para cada produto de PCR que pode ser usada somente uma única vez, o que encarece a análise (VAN DEN BRULE et al., 2002).

Os métodos de hibridização reversa utilizam um produto de PCR biotinilado que se hibridizam à sondas oligonucleotídeas imobilizadas. Este método permite a discriminação de múltiplos genótipos através de uma única hibridização e ciclo de lavagem (GRAVITT et al., 1998).

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3 OBJETIVOS