Métodos de preparação de scaffolds

Com o objetivo de satisfazer os requisitos necessários às suas funções, os scaffolds devem ser fabricados a partir de biomateriais com propriedades adequadas aos tecidos que se pretende reparar (tecidos moles ou duros), mas esses requisitos básicos juntamente com as exigências geométricas tornam a fabricação do scaffold num processo complexo que exige conhecimentos sobre as caraterísticas dos materiais. Assim a seleção do processo de fabrico adequado terá que ser baseada nas caraterísticas do tecido a regenerar, nas do material a utilizar e na complexidade do design do scaffold [63, 64].

Têm sido desenvolvidas várias técnicas de fabricação de estruturas porosas 3D, tal como se sumariza na Tabela 2, de modo a melhorar a função e estrutura dos scaffolds.

Tabela 2 – Exemplos de algumas técnicas de fabricação de scaffolds[19].

Técnica Vantagem Desvantagem

Evaporação de solvente/lixiviação de solvente Fácil controlo de porosidade, de tamanho de poro e de cristalinidade Propriedades mecânicas limitadas, resíduos de solvente e de porogénios Lixiviação de porogénios Bom controlo de porosidade

e geometria do poro

Interconetividade e tamanho de poros inadequada

Gas foaming Isento de solventes

orgânicos nocivos Propriedades mecânicas inadequadas e interconetividade de poros inadequada Self Assembly Fácil controlo da porosidade, diâmetro das fibras e tamanho do poro

Materiais caros e complexidade de fabrico

Electrospinning

Bom controlo da porosidade, diâmetro das fibras e tamanho do poro

Propriedades mecânicas limitadas e o tamanho de

poro diminui com a espessura da fibra Prototipagem rápida Excelente controlo de

geometria e porosidade.

Equipamento caro, limitado a certos tipos de polímeros.

Fiber mesh

Área superficial elevada para a ligação celular, difusão rápida de nutrientes.

Ausência de estabilidade estrutural

Na Figura 12 ilustram-se scaffolds produzidos por algumas destas técnicas.

Retirado de ref. [30].

Na secção seguinte abordar-se-ão, mais detalhadamente, a separação de fase sólido/líquido (congelamento e liofilização) uma vez que foi a técnica utilizada na produção dos scaffolds da presente tese.

2.4.1. Separação de fase sólido/líquido

A técnica de separação de fase usa o facto de um sistema homogéneo, tal como uma solução polimérica, poder tornar-se termodinamicamente instável e evoluir para uma separação de fases por forma a reduzir a energia livre do sistema [65]. No caso de soluções poliméricas obtidas por dissolução do polímero num solvente (no caso do presente trabalho o quitosano é dissolvido numa solução aquosa de ácido acético), a separação de fases é induzida por congelamento. Posteriormente o solvente é removido, tanto por liofilização como por extração de solvente, e no espaço ocupado inicialmente pelo solvente formam-se poros.

A arquitetura do scaffold (interconetividade e distribuição de tamanho do poro) pode ser controlada pela manipulação das condições experimentais da separação de fase designadamente as caraterísticas químicas da solução de polímero e as condições de congelamento [66]. Estudos recentes [7] mostraram que o tamanho e morfologia de poro dos scaffolds são condicionados pelo pH das suspensões e pela temperatura de congelamento das soluções poliméricas. No mesmo estudo foram preparadas soluções de CH a diferentes valores de pH (pH=2 e pH=5) as quais foram congeladas a três temperaturas diferentes antes de serem liofilizadas (T=-196ºC, T=-15ºC e T=0ºC). O valor de pH mais elevado (pH=5) e a temperatura de congelamento mais elevada (T=0ºC) foram

Figura 12 - Scaffolds porosos desenvolvidos por a) gas foaming, b) sinterização de microesferas e c) electrospinning.

as condições que mais favoreceram o crescimento de cristais de gelo e por conseguinte a formação de poros de maior dimensão. A variação da taxa de congelamento também influencia a morfologia do scaffold, mostrando que uma taxa de congelamento rápida produz poros pequenos [19, 67].

Ma e Zhang [68] também fabricaram um scaffold altamente poroso com uma matriz orientada de microtubos usando a técnica de separação de fase modificada, ou seja, realizada com um gradiente de temperatura uniaxial. Para atingir este gradiente de temperatura direcional, o copo na qual foi colocada a solução polimérica foi coberto com uma camada de material isolante térmico, para reduzir a transferência de calor através da parede lateral do copo, e fixado no topo de um bloco de metal, para aumentar a condução de calor ao longo da direção longitudinal. Esta técnica também foi usada por para fabricar scaffolds fibrosos [69]. No entanto quando se usam solventes orgânicos para criar poros dentro dos scaffolds e como a remoção do solvente não é totalmente completa, os solventes tornam-se uma potencial fonte de citotoxicidade para as células. Porém já existem técnicas de elevada pressão de gás CO2 [9, 70], como o método do fluido supercrítico, que evitam o

uso de solventes tóxicos na fabricação do scaffold. Nesta técnica o polímero é exposto ao CO2 que o plastifica devido à redução da temperatura de transição vítrea ou do ponto de

fusão. Acima de uma certa temperatura (31ºC) e pressão (73,8bar), o CO2 passa para um

estado intermediário entre o líquido e o gasoso: torna-se “supercrítico”, podendo então agir como solvente. O CO2 em estado supercrítico pode dissolver ou incorporar a maioria das

moléculas orgânicas. 2.4.2. Liofilização

A técnica de liofilização é baseada no princípio da sublimação e usada para fabricar scaffolds porosos. Como descrito anteriormente, numa etapa inicial o polímero é dissolvido num solvente para formar uma solução polimérica com a concentração desejada. Em seguida, a solução é congelada e posteriormente o solvente sólido, já separado do soluto (polímero), é removido por liofilização sob vácuo de modo a serem produzidas matrizes com elevada porosidade e interconetividade.

Após a liofilização, os scaffolds tendem a apresentar um comportamento higroscópico: a adsorção da humidade ambiente pode originar uma alteração da estrutura porosa, ou seja, os poros do scaffold fecham parcialmente dando lugar a uma estrutura mais compacta. Para evitar a captação de humidade por parte dos scaffolds é necessário

recorrer a tratamentos da superfície. No caso dos scaffolds de CH, como não se dissolvem em etanol, alguns autores recorrem ao tratamento em etanol [45, 50] como forma de minimizar a afinidade da superfície para a humidade atmosférica. O scaffold de quitosano resultante da liofilização contém iões acetato ligados quimicamente aos grupos amina. São, na verdade, os iões acetato que conferem a higroscopicidade ao scaffold. Para evitar esse facto, deve proceder-se à recuperação do quitosano original, isto é, do quitosano livre de grupos acetato pelo tratamento em etanol.

Hsieh et al [50] investigaram a influência de três variáveis na fabricação de scaffolds de quitosano porosos. Utilizaram quatro temperaturas de congelamento (-20, -40, -60 e -80ºC), diferentes concentrações de ácido acético (1-2M) e diferentes concentrações de etanol (0, 50 e 95%) verificando que a temperatura de congelamento mais elevada (- 20ºC) e a elevada concentração de ácido acético (2M) melhoram as propriedades mecânicas dos scaffolds enquanto que uma concentração elevada de etanol diminui as mesmas.

A principal vantagem da liofilização reside no facto de não necessitar de altas temperaturas nem de distintas etapas de lixiviação. No entanto é um processo demorado e o tamanho dos poros é pequeno (normalmente <500µm) [71].