Métodos ex-situ (Técnicas clássicas de microbiologia)

Desde o século XIX, a classificação taxonómica das bactérias tem sido efectuada ao longo dos anos com base em características morfológicas, fisiológicas e metabólicas, após recolha e obtenção de culturas puras isoladas em meios de cultura específicos. Consequentemente, a análise de uma população bacteriana dependia do crescimento dos microrganismos em meios nutrientes artificiais e selectivos. O aparecimento de métodos de caracterização da actividade metabólica microbiana, tais como os baseados em testes colorimétricos (e.g. microplacas do sistema Biolog Inc, USA) (Garland et al., 1991), contribuiu substancialmente para aumentar e melhorar a informação sobre o potencial metabólico de uma comunidade em estudo, permitindo uma mais rigorosa identificação dos seus membros.

As técnicas de cultura, embora não dispendiosas nem complexas, são morosas, requerem um trabalho intensivo e, além disso, falham ao tentar reproduzir in vitro as condições dos respectivos nichos ecológicos e as relações simbióticas encontradas nos ambientes naturais complexos, necessárias para averiguar o espectro completo da diversidade microbiana (Entcheva et al., 2001; Nocker et al., 2007), assim como não permitem determinar a representatividade dos seus membros em termos de predominância relativa. Os pioneiros em microbiologia ambiental reconhecem que, neste tipo de amostras, uma grande percentagem de microrganismos pode ser viável mas não é cultivável, o que pode ser constatado através de contagens directas ao microscópio que excedem em vários graus de magnitude as contagens de células viáveis (Kent et al., 2002, McInerney et al., 2002; Zoetendal et al., 2004), levando ao termo “Great Plate Count Anomaly” (grande anomalia em contagens de placas; Amann

et al., 1995; Staley & Konopka, 1985).

O Estado Viável mas Não-Cultivável (VBNC, “viable but nonculturable”), que se refere a um estado no qual não se consegue cultivar os microrganismos embora estes mantenham algumas características de células viáveis, tal como a actividade e integridade celular (e.g. Binnerup et al., 1993; Roszak & Colwell, 1987), veio tornar o conceito de viabilidade mais complexo. A possibilidade de bactérias entrarem em estado VBNC sob condições ambientais, quer in vivo quer in vitro, tem uma importância muito significativa para a Ecologia Microbiana e para a Microbiologia Molecular. Foi proposto que a “Great Plate Count Anomaly” podia ser parcialmente explicada por bactérias em estado VBNC, e que este estado poderia ser uma estratégia adaptativa de sobrevivência, em condições adversas, para bactérias que não esporulam (Roszak & Colwell, 1987). Após mais de duas décadas de pesquisa, colocou-se a hipótese de que a lesão, e subsequente morte celular, fossem as causas para alguns dos ‘fenómenos

VBNC’, razão pela qual este termo VBNC é por vezes substituído por ‘activo’, ‘cultivável’, ‘viável’ ou ‘latente’ (Kell et al., 1998; Weichart 1999). Assim, o ‘comportamento VBNC’ pode ser uma resposta fisiológica de algumas bactérias, programada geneticamente para aumentar a sobrevivência a um stress ambiental. Esta hipótese poderá ser comprovada se células VBNC puderem sair deste estado de latência e voltar a um estado metabolicamente activo, quando as condições se tornarem favoráveis (McDougald et al., 1998).

As técnicas de plaqueamento permitem obter isolados para analisar e comparar comunidades bacterianas pelo agrupamento desses isolados em OTUs, possibilitando a comparação dos elementos de diversidade numa amostra, por estimativa (composição - os filótipos de bactérias presentes; riqueza - o número de filótipos; e estrutura - a frequência da distribuição ou abundância relativa dos filótipos), mas não fornecem a descrição exacta da diversidade da comunidade in situ. Por exemplo, o facto de microrganismos cultiváveis entrarem num estado viável, mas não cultivável, pode distorcer significativamente a abundância relativa de um microrganismo numa determinada comunidade (Dunbar et al., 1999). Por outro lado, as espécies procariotas que se adaptam rapidamente e crescem in vitro, podem nem ser representativas, nem serem os principais componentes da comunidade da qual são membros naturais. O crescimento em placas favorece as bactérias com taxas de crescimento mais rápido, e fungos que produzem um número maior de esporos, limitando o estudo da diversidade aparente (Kirk et al., 2004; McInerney et al., 2002) e a oportunidade de estudar as capacidades genética, bioquímica e metabólica da grande maioria dos microrganismos. Outro factor crucial é que os microrganismos que evoluem numa comunidade são afectados pela presença e pelo estado de outros microrganismos que estejam na sua vizinhança, sabendo-se que existe uma pletora de interacções positivas e negativas entre eles (Ritz 2007).

No entanto, as abordagens baseadas em culturas de microrganismos são essenciais para o conhecimento do potencial fisiológico de culturas puras e para avaliar as vias metabólicas da degradação de alguns compostos. Além disso, este conhecimento é de grande importância para se conseguir obter uma melhor visualização da funcionalidade destes microrganismos nos seus ambientes naturais (Sousa, 2006). Na última década, fizeram-se importantes contribuições para diminuir as restrições inerentes às técnicas de cultivo (Ferrari et al., 2005; Hahn et al., 2004; Joseph

et al., 2003; Nichols 2007; Sait et al., 2002; Stevenson et al., 2004; Zengler et al., 2002),

usando metodologias tradicionais, mas combinando condições in vivo e in vitro de formas diferentes, como por exemplo, usando membranas de diálise para libertar

factores de crescimento ambientais para os microrganismos durante a incubação. Estes estudos permitem uma melhor recuperação microbiana in vitro, em termos de percentagem e diversidade, o que aumentou significativamente a confiaça nos resultados destas metodologias e contribuiu também para a diminuição dos custos financeiros inerentes.

Um procedimento ex-situ, frequentemente utilizado, é o enriquecimento de culturas, muito adequado para: i) pesquisa de microrganismos para estudos fundamentais para a bioquímica, fisiologia, genética ou desenvolvimento, em que o crescimento in vitro é um pré-requisito para obter isolados e/ou biomassa suficiente; ii) detecção e isolamento de microrganismos com potencial biotecnológico; iii) usar com meios selectivos para demonstrar a presença de um determinado microrganismo num sistema (Ritz 2007).

Técnicas baseadas em cultura – As suspensões de células, que devem ser diluídas

serialmente, são plaqueadas em meio sólido para obter colónias isoladas, as quais são por sua vez submetidas a testes bioquímicos e fenotípicos para identificação das espécies (Faoro, 2006). A existência, no ambiente, de um grande número de microrganismos não cultiváveis significa que, por definição, todos os meios de cultura são selectivos, embora alguns meios de crescimento, tal como o Nutrient Agar, sejam considerados meios não-selectivos (Keyser et al., 2006). Consoante o tipo de microrganismos que se pretende seleccionar, a incubação das culturas é realizada a diferentes temperaturas: >55ºC para termotolerantes ou termofílicos, <10ºC para psicrotróficos, e entre 5 e 55ºC para mesofílicos; sendo o período de incubação utilizado para determinar as taxas de crescimento. A complexidade físico-química e biológica do ambiente tem, forçosamente, influência no comportamento do microrganismo, podendo, por exemplo, comprometer os processos de divisão e produção de metabolitos. Em condições laboratoriais, os factores temperatura, nível de oxigénio, pH, salinidade e matrizes de crescimento, entre outros, são intrínsecos aos sistemas de crescimento empregues nas culturas de microrganismos (Nichols 2007). No final da incubação, os microrganismos podem ser detectados com base no crescimento celular e quantificados pela contagem do número de colónias presentes, assumindo que cada organismo presente na amostra original produziu uma colónia (CFU, “colony forming units”) (WS Atkins Environment, 2000). No entanto, o tamanho microscópico dos microrganismos e, em muitos casos, a dependência de hospedeiros e de substratos específicos para a sua sobrevivência e multiplicação, são limitações significativas para os métodos de cultura tradicionais (Torsvik & Øvreås, 2002).

Biolog – A taxonomia bacteriana também se pode basear na capacidade que os

microrganismos têm para utilizar certos substratos ou crescer em determinadas condições ambientais. As propriedades de utilização do substrato foram exploradas num sistema comercializado pela Biolog® _{Corporation que se baseia numa técnica de}

microplacas, em que o perfil de utilização dos substratos por uma cultura de bactérias (determinada como sendo uma única espécie ou estirpe) pode ser imediatamente comprovado e utilizado para identificar o microrganismo por correspondência com os perfis de utilização de substratos associados a tipos conhecidos. Este sistema pode ser aplicado para detecção e identificação de bactérias e fungos, como se baseia no crescimento, não é obviamente adequado a microrganismos não cultiváveis. Garland & Mills (1991) adaptaram esta técnica ao estudo das comunidades de solos, inoculando suspensões de solos no sistema, em vez de culturas de microrganismos isolados. A abordagem, designada por perfil fisiológico ao nível da comunidade (CLPP, “community- level physiological profiling”), foi rapidamente adoptada e tem sido aplicada a amostras provenientes de um grande número de ecossistemas.

Análise de Ácidos Gordos – Esta análise detecta e identifica os microrganismos com

base no tipo e quantidade relativa de moléculas de ácidos gordos presentes nas suas membranas (Descheemaker & Swings, 1995). Isto é, os ácidos gordos individuais estão distribuídos de forma descontínua entre os diferentes taxa microbianos e assim cada

taxon individual tem um “fingerprint” de ácidos gordos distinto. A aplicação desta técnica

na detecção e identificação de bactérias e fungos possibilita a obtenção de um perfil da comunidade, conhecendo-se duas análises deste tipo: perfis de ácidos gordos fosfolipídicos (PLFA, “phospholipid fatty acid”) e de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME, “fatty acid methyl ester”) (Kozdrój & van Elsas, 2001).