MÉTODOS EXPERIMENTAIS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE

A atividade antioxidante de uma substância não pode ser mensurada diretamente, mas através dos seus efeitos sobre um substrato ou sistema passível de ser monitorado. A maioria desses métodos usa processos oxidativos, que envolvem a adição de um agente iniciador, como a temperatura, agitação ou uma pressão parcial de O2, um metal de transição ou mesmo exposição à luz, para acelerar o processo, e uma fonte de radicais livres específica. Esses radicais são, então, oxidados sob condições padronizadas e o grau de oxidação, ou sua extensão, medido (ANTOLOVICH et al., 2002).

Muitos métodos e modos de expressar a atividade antioxidante de extratos obtidos de plantas têm sido utilizados, onde o efeito de várias concentrações é comparado ao efeito exercido por uma substância de referência, como as vitaminas C ou a E, ou mesmo um composto puro, como a quercitina e a rutina. Contudo,

como recentemente destacado por Antolovich et al. (2002), distinção entre atividade antioxidante e capacidade antioxidante deve estar presente quando se interpreta os resultados, uma vez que esta refere-se à somatória de todas as atividades antioxidantes exercidas individualmente por cada componente presente em uma mistura, como é o caso de extratos.

Várias metodologias têm sido descritas para uma avaliação rápida da capacidade e eficácia antioxidante de compostos químicos e extratos vegetais. Muitos testes recorrem a formação de radicais livres instáveis, pela decomposição térmica de iniciadores, tais como o ABAP (MIGUEL et al., 2004; MORAIS et al., 2006), ABTS⁺ (RE et al., 1999; ARTS et al., 2004; SOARES , ANDREAZZA e SALVADOR, 2005), AAPH (MITJANS et al., 2004; YU et al., 2007), os quais reagem rapidamente como o oxigênio originando radicais peroxilas.

Alguns autores propõem outros tipos de teste que não recorrem à oxidação de substratos, mas à redução de radicais livres estáveis gerados in vitro, como resultado da atividade antioxidante dos extratos ou substâncias avaliadas. Entre esses, destaca-se o método original de Blois (BLOIS, 1958), adaptado por vários autores, no qual o radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), que é um radical livre estável (DPPH^•), que na presença de um antioxidante doador de hidrogênio (AH), pode ser reduzido em meio alcoólico, formando difenil picrilhidrazina (Figura 11) (KOLEVA et al., 2002).

Figura 11 - Mecanismo de redução do radical livre DPPH + AH .. .. .. .. .. O2N NO2 NO2 N N

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1,1-difenil-2-picrilhidrazil

O ensaio de redução do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH^•) tem sido amplamente utilizado como um método químico para a investigação do potencial antioxidante de produtos naturais, particularmente para extratos de plantas medicinais (BRACA et al., 2001; LU e FOOD, 2001; MENSOR , MENEZES , LEITAO , REIS , SANTOS et al., 2001; BRACA et al., 2002) e vegetais comestíveis (GUO et al.., 2001; SANDOVAL et al.., 2002; LLORACH et al., 2003).

A redução pode ser acompanhada espectrometricamente em 518 nm, pela diminuição da absorbância, com simultânea mudança da coloração violeta escura original da solução para amarela, descorando à medida que a reação com a solução teste se processa. Quanto maior a atividade antioxidante, menor será a coloração violeta da solução, ou seja, o DPPH^• residual, mensurado após certo tempo, corresponde inversamente à capacidade antioxidante da substância analisada.

A molécula do DPPH^• apresenta um máximo de absorção a 517-520 nm e após ser reduzida por uma substância doadora de elétrons, observa-se uma diminuição da absorbância. As variações nas condições iniciais do ensaio, como mostrado por diferentes autores, que empregam diferentes concentrações iniciais de DPPH^•, combinados com diferentes tempos de reação, não resultam em mudanças significativas na interpretação dos resultados. Porém a interação de um antioxidante em potencial com o DPPH^• depende de sua conformação estrutural.Em termos analíticos, o método do é recomendado para avaliar a atividade antioxidante de extratos vegetais e produtos, por fornecer resultados reprodutíveis e confiáveis de forma rápida e fácil (KOJIMA , MIZUNO e MIYAZAKI, 1958; BONDET , BRAND-WILLIAMS e BERSET, 1997; HIRANO et al.., 2001; MENSOR , MENEZES , LEITAO, REIS , DOS SANTOS et al.., 2001; KOLEVA et al., 2002; MOLYNEUX, 2004).

A molécula do DPPH^• é caracterizada como um radical livre estável em virtude da delocalização do elétron excedente, impedindo a dimerização, como ocorre com a maioria dos radicais livres. A delocalização também resulta em um aumento de intesidade da coloração violeta, caracterizado pela absorção em solução etanólica em torno de 520 nm. Quando a solução de DPPH é mistura com substâncias que podem doar átomos de hidrogênio, o DPPH reduz-se e diminui portanto, a intensidade da coloração violeta (MOLYNEUX, 2004).

Os mecanismos de reação propostos para o método do DPPH^•, descritos por Brand-Williams et al. (1995, 1997) para substâncias fenólicas, parecem envolver, de forma isolada ou combinada, a (RAO e AGARWAL) dimerização entre dois radicais fenoxil, seguida da regeneração de dois grupos hidroxila pela transferência do hidrogênio, podendo novamente reagir com DPPH^• e (AAO) uma molécula de DPPH^• pode complexar-se com um radical aril, conforme demonstrado na Figura 12. R O H R O R O R O R O R O R O OH OH R R N N O₂N NO₂ NO₂ N N O₂N NO₂ NO₂ DPPH DPPH-H R 1 O 2

Figura 12- Proposta de mecanismos de reação para substâncias fenólicas com DPPH

Nota: [1] dimerização entre dois radicais fenoxil, seguida da regeneração de dois grupos hidroxila pela transferência do hidrogênio, podendo novamente reagir com DPPH^• e (AAO) uma molécula de DPPH^• pode complexar-se com um radical aril, os quais podem ocorrer de forma isolada ou combinada. Fonte: BRAND-WILLIAMS, 1995

O método do DPPH mostra-se como uma alternativa rápida, pois ocorre em aproximadamente 30 min, de custo praticável por utilizar reagentes acessíveis e por não necessitar de equipamentos sofisticados. Além disso, nesse método, a eficiência antioxidante é mensurada em temperatura ambiente, eliminando-se o risco potencial de degradação térmica de algumas das substâncias analisadas (BONDET , BRAND-WILLIAMS e BERSET, 1997; MOLYNEUX, 2004).

Assim, no presente trabalho, a capacidade antioxidante de extratos obtidos alface, rúcula e almeirão, provenientes de uma horta experimental onde estas hortaliças foram cultivadas sob sistema orgânico e convencional foi investigado usando o método químico da redução do DPPH.

2.4 OBJETIVOS

2.4.1 Objetivo Principal

• Avaliar a capacidade antioxidante de extratos de hortaliças usados na dieta regular, obtidos de cultivos orgânico e convencional utilizando o método de redução do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), tendo a vitamina C como referência.

2.4.2 Objetivos Específicos

1. Avaliar in vitro da capacidade antioxidante dos extratos metanólicos de Lactuca sativa cultivar Verônica (alface), Eruca sativa (rúcula) e Cichorium intybus L. (almeirão) provenientes das hortas experimentais orgânica e convencional.

2. Quantificar o teor de fenólicos das hortaliças cultivadas nas hortas experimentais

3. Verificar se existe diferença entre as hortaliças cultivadas de forma orgânica e convencional em relação ao potencial antioxidante e teor de fenólicos.

3 METODOLOGIA