Métodos de hidrólise de proteínas para análise de aminoácidos

A separação dos aminoácidos de uma proteína classicamente é realizada através da hidrólise das ligações peptídicas, para isso, tradicionalmente utiliza-se a reação com ácido clorídrico a quente, sob refluxo ou em frasco selado (HARFENIST, 1953; HIRS et al., 1954). No

entanto, alguns aminoácidos sofrem degradação sob essas condições, o que faz necessário a utilização de múltiplas hidrólises para a correta quantificação dos aminoácidos em proteínas. Os aminoácidos sulfurados, metionina e cisteína, necessitam de uma prévia oxidação para que possam resistir à hidrólise ácida. Por outro lado, o triptofano é sensível a presença de ácido, por esta razão se faz necessária a utilização de uma hidrólise alcalina.

2.6.2.1 Hidrólise ácida

A hidrólise com ácido clorídrico, em geral na concentração de 6N ou aproximadamente 20% (constant boiling), é realizada em tubos selados na ausência de oxigênio. São necessárias 24 horas a 110o_{C para a completa liberação dos aminoácidos, no}

entanto, existe uma infinidade de modificações neste método visando a redução deste tempo. Westall e Hesser (1974) aperfeiçoaram as condições da hidrólise ácida de peptídeos de modo que reduziram os tempos de hidrólise para 15 minutos a 160o_{C ou 2 horas a 130}o_C.

Savoy et al. (1975) realizaram extensos testes com a hidrólise ácida em alimentos, os melhores resultados obtidos foram em ampolas seladas com uma razão de 5:1 de ácido para a quantidade de proteína.

Metodologias com a utilização de micro-ondas para realização da hidrólise ácida também foram desenvolvidas, no entanto, são necessários equipamentos e material adequado para este tipo de hidrólise (CHIOU e WANG, 1989; KROLL et al., 1998).

Devido a complexidade da matriz alimentícia, em relação a sua grande variabilidade de composição e a quantidade e tipo de proteína, as condições de hidrólise para a determinação de aminoácidos deveria ser otimizada para cada matriz estudada (ALBIN et al.,

2000). No entanto, por razões de praticidade e padronização, o comumente utilizado é a hidrólise com ácido clorídrico a 6N por 24h a 110o_{C em frascos selados.}

A hidrólise ácida é recomendada para a determinação da maioria dos aminoácidos, com exceção dos sulfurados e do triptofano. Pode ser utilizada também para a análise da hidroxiprolina, um aminoácido não essencial exclusivo do colágeno. A quantificação da hidroxiprolina é uma maneira indireta da determinação da quantidade de colágeno, o que pode ser útil na avaliação da maciez de carnes que está relacionada, dentre outros fatores, com o teor de colágeno (KOLAR, 1990; ABREU et al., 2011).

2.6.2.2 Hidrólise alcalina para quantificação do triptofano

São do início dos anos de 1830 os primeiros relatos de derivados coloridos de uma substância obtida de proteínas. Existem relatos desses derivados coloridos reportados por mais de 70 anos, inclusive constatações de que esses derivados apresentavam odor semelhante ao dos compostos derivados do indol. Desta maneira, sem saber a estrutura do composto responsável por esses derivados, Neumeister afirma, em 1890, que este composto obtido da hidrólise de proteínas provavelmente contém um grupo indol em sua estrutura. Foi Neumeister quem batizou a substância como triptofano, oriundo do grego e referindo-se à sua ocorrência em hidrolisados de proteínas obtidos com a enzima tripsina. Hopkins e Cole foram os primeiros a isolar o triptofano (Figura 41 página 57) em 1901 (FRIEDMAN e FINLEY, 1971).

57 A análise do triptofano foi e ainda tem sido um dos maiores desafios para a química analítica. A primeira razão para isso é devido à grande importância do triptofano, sendo aminoácido essencial para muitos animais, e por participar de inúmeras funções biológicas como, por exemplo, ser precursor da serotonina (Figura 41). A segunda razão consiste na grande dificuldade em manter estável o triptofano proveniente da hidrólise das proteínas (MOLNÁR-PERL, 1997).

Figura 41 – Molécula do aminoácido triptofano, precursor da serotonina.

A determinação de triptofano livre por espectrometria ou cromatografia líquida é relativamente simples, haja vista que a molécula é facilmente separada por fase reversa e é naturalmente fluorescente, além de ter forte absorção na região do ultravioleta (DEVRIES et al., 1980; MOLNÁR-PERL, 1997).

Já a determinação de triptofano em hidrolisados proteicos é mais trabalhosa, muitos métodos de hidrólise foram testados. Quando se pretende determinar apenas o triptofano, a hidrólise alcalina é sugerida (OELSHLEGEL et al., 1970; HUGLI e MOORE, 1972; SATO et al.,

1984). Agentes protetores, como o amido, são sugeridos para aumentar a recuperação (DREZE, 1960). Quando se pretende determinar o triptofano juntamente com os demais aminoácidos, são necessárias hidrólises alternativas, como enzimáticas, com ácidos orgânicos (SIMPSON et al., 1976) e até mesmo com HCl utilizando-se agentes protetores (WONG et al., 1984;

MOLNÁR-PERL, 1997). Preferencialmente, a hidrólise deve ser conduzida em frasco inerte fechado e com atmosfera inerte, o que exclui a necessidade do uso de agentes antioxidantes (SPIES e CHAMBERS, 1949).

2.6.2.3 Oxidação com ácido perfórmico para aminoácidos sulfurados

Os aminoácidos sulfurados, cisteína e metionina (Figura 42 página 58), enquanto ligados à proteína, não podem ser determinadas via hidrólise ácida, pois ambos formam múltiplos derivados além de sofrerem degradação. A solução analítica é promover uma prévia oxidação, ainda enquanto ligadas à proteína, para ácido cistéico e metionina sulfona. A oxidação é realizada com ácido perfórmico a frio, na sequencia procede-se a rotina analítica com a hidrólise ácida (MACDONALD et al., 1985; ALLRED e MACDONALD, 1988; TORAN et al.,

1996). Triptofano Serotonina HN OH H2N H O N_H2 HO HN Indol

58

Figura 42 – Moléculas dos aminoácidos sulfurados cisteína e metionina.

Devido a sua instabilidade, o preparo do ácido perfórmico geralmente é realizado in

situ, para isso utiliza-se a reação de eliminação de água com a mistura de ácido fórmico e

peróxido de hidrogênio (Figura 43) (GIBSON, 1969).

Figura 43 – Preparo do ácido perfórmico.

Fonte: GIBSON, 1969, p. 677.

A utilização da oxidação dos aminoácidos sulfurados de proteínas já havia sido utilizada para a inativação da metionina para estudos com esse aminoácido essencial (TOENNIES, 1942). A aplicação deste método para a análise dos aminoácidos sulfurados por cromatografia líquida foi proposto por Schram et al. (1954).

Após o tempo estabelecido para a oxidação dos aminoácidos sulfurados, a reação deve ser interrompida para evitar superoxidação. Para isto, utilizam-se agentes redutores para degradar o excesso de ácido perfórmico, o agente mais comumente utilizado e eficiente é o ácido bromídrico. O bromo gerado nesta reação pode ser facilmente eliminado do meio com aplicação de vácuo (MOORE, 1963).