MÉTODOS LABORATORIAIS 1 Análise do perfil lipídico sérico

Os conjuntos de reagentes para as determinações do colesterol total, HDL-c, LDL-c e triglicerídeos foram obtidos da empresa Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa Santa – MG) e as análises bioquímicas foram realizadas em equipamento automatizado Cobas Mira Plus® (Roche Diagnósticos, Basel, Suíça). O controle de qualidade foi realizado utilizando-se soro controle da empresa RANDOX Laboratories Ltda (Antrim, Reino Unido), obtendo-se coeficientes de variação interensaios de 2,5% a 5,4% conforme a análise.

A concentração sérica de colesterol total foi determinada pelo método colorimétrico de ponto final utilizando a reação enzimática de Trinder. Neste método, os ésteres de colesterol são hidrolisados pela enzima colesterol-esterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre é oxidado pela colesterol-oxidase formando peróxido de hidrogênio que através da ação da peroxidase e juntamente com a 4- aminoantipirina e o fenol forma a antipirilquinoneímina, um produto de coloração rosa cuja intensidade é proporcional à quantidade de colesterol na amostra.

A concentração sérica de triglicerídeos foi determinada pelo método colorimétrico de ponto final utilizando a reação enzimática de Trinder. Neste método, a enzima lipase promove a hidrólise dos triglicerídeos liberando glicerol que é convertido em glicerol-3-fostato pela ação da glicerol-3-fosfato desidrogenase. Este é oxidado formando peróxido de hidrogênio que, através da ação da peroxidase e juntamente com a 4-aminoantipirina e o diclorofenol, forma quinoneímina, cuja intensidade é proporcional à quantidade de triglicerídeos na amostra.

O HDL-colesterol foi determinado por método homogêneo. Neste método, através da ação de um acelerador, o colesterol livre das lipoproteínas não-HDL é oxidado formando peróxido de hidrogênio, que sofre ação da peroxidase formando um produto incolor. Em seguida, um detergente solubiliza exclusivamente o colesterol da HDL, que também reage com a enzima colesterol oxidase formando peróxido de hidrogênio que, na presença de 4-aminoantipirina e N,N-Bis-(4- sulfobutil)-3-metilanina e sob ação da peroxidase, forma um produto cuja intensidade é proporcional à quantidade de HDL na amostra.

O LDL-colesterol foi estimado pela equação de Friedewald [LDL- c = CT - (HDL + TG/5)] (FRIEDEWALD; LEVY; FREDRICKSON, 1972). A fração sd-LDL foi determinada após a precipitação seletiva

das demais lipoproteínascom heparina e cloreto de magnésio, conforme procedimento descrito previamente por Hirano et al. (2003) e modificado por Cavalcante e Silva (2012). A quantificação do sd-LDL- colesterol foi feita através do método LDL-c homogêneo, que utiliza um surfactante que solubiliza as lipoproteínas HDL e VLDL. O colesterol solubilizado é consumido em uma reação não formadora de cor. Em uma segunda fase da reação, um novo surfactante solubiliza o colesterol da LDL, que reage com a enzima colesterol-oxidase dando origem ao peróxido de hidrogênio. Em seguida, ocorre uma reação de acoplamento entre o peróxido de hidrogênio, a 4-aminoantipirina e a disulfobutilmetatoluidina sódica (DSBmT), catalisada pela enzima peroxidase, produzindo a quinoneímina com absorbância máxima em 546 nm, cuja intensidade é proporcional à presença de sd-LDL na amostra.

O não-HDL-colesterol foi estimado pela diferença entre o valor de colesterol total e o HDL-c (Não-HDL-c = CT – HDL-c). O índice de Castelli I foi estimado pela razão CT/HDL-c e o índice de Castelli II pela razão LDL-c/HDL-c (CASTELLI et al, 1983). O tamanho da LDL foi estimada por meio da equação: [LDL (nm) = 26,262 - 0,776 (TG

mmol/L/HDL-c mmol/L)] (MARUYAMA, IMAMURA &

TERAMOTO, 2003).

3.3.2 Análise de marcadores glicêmicos

O conjunto de reagentes para as determinações da glicose sérica foi obtido da empresa Labtest Diagnóstica S.A. A concentração de glicose foi determinada pelo método colorimétrico e de ponto final utilizando a reação de Trinder. Neste método, a glicose é oxidada formando peróxido de hidrogênio, que através da ação catalisadora da peroxidase e juntamente com a 4-aminoantipirina e o diclorofenol forma a antipirilquinoneímina, cuja intensidade de cor é proporcional à quantidade de glicose na amostra. O controle de qualidade foi realizado utilizando soro controle da empresa RANDOX Laboratories Ltda (Antrim, United Kingdom), obtendo-se CV interensaios de 4%.

A quantificação da insulina foi realizada por método de quimiluminescência com enzima marcada. Neste método, a fase sólida é revestida com anticorpo monoclonal anti-insulina e a fase líquida é constituída pela enzima fosfatase alcalina conjugada com anticorpo policlonal anti-insulina e fosfatase alcalina conjugada com anticorpo monoclonal anti-anticorpo anti-insulina. Após incubação, o substrato quimioluminescente é adicionado à reação e o sinal gerado é

proporcional à quantidade de insulina da amostra. O procedimento foi realizado em equipamento automatizado Immulite 2000 (Siemens Healthcare Diagnostic Inc - EUA) com conjunto de reagentes Siemens Healthcare Diagnostic Inc - EUA. O controle de qualidade foi realizado com o Immulite Insulin Controls nível normal e elevado, tendo como CVs 11,3 e 9,4%, respectivamente.

A resistência à insulina foi estimada utilizando-se a equação (HOMAi = insulina sérica de jejum (μUI/mL) x glicose sérica de jejum (mg/dL)/405) (MATHEWS et al, 1985).

3.3.3 Análise de marcadores inflamatórios

O conjunto de reagentes para a medida do ácido úrico sérico foi obtido da empresa Labtest Diagnóstica S.A. O ácido úrico foi determinado pelo método colorimétrico e de ponto final utilizando a reação de Trinder. Neste método, o ácido úrico é oxidado pela uricase formando peróxido de hidrogênio, este, por sua vez, é utilizado na reação de acoplamento oxidativo com a 4-aminoantipirina e com o ácido di-hidroxi-benzeno-sulfônico, sob ação da enzima peroxidase formando a antipirilquinoneimina, cuja intensidade da cor é proporcional à quantidade de ácido úrico na amostra. O controle de qualidade foi realizado utilizando soro controle da empresa RANDOX Laboratories Ltda (Antrim, United Kingdom), obtendo-se CV interensaios de 4,4%.

A concentração da PCR-as foi avaliada por imunonefelometria. Neste método, são utilizadas partículas de poliestireno revestidas com anticorpo monoclonal anti-PCR que, ao se ligarem com a PCR no soro, aglutinam e dispersam a luz irradiada. A intensidade da luz dispersa depende da concentração da proteína na amostra. O procedimento foi realizado no aparelho automatizado Nefelômetro Behring BN II (Siemans Healthcare Diagnostics Products GMBH - Alemanha), com conjunto de reagentes Siemens Healthcare Diagnostic Inc - EUA. Foi utilizado como controle de qualidade RH Control SL/1 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc - EUA), tendo como CV 2,7%.