Métodos

A permeação de substâncias ativas na pele depende de dois passos consecutivos: liberação dessa substância pelo veículo e penetração cutânea. As substâncias ativas incorporadas em veículos inadequados podem penetrar pouco ou quase nada na pele. Baseado neste fato, é possível considerar que estudos prévios são necessários sobre a liberação do ativo para a realização do teste de permeação cutânea. Para determinar a liberação ou cedência do ácido alfa-lipóico das emulsões O/A, o teste de permeação propriamente dito e os testes de retenção no estrato córneo e na epiderme/derme (ALENCASTRE et al., 2006; BENTLEY, 1994; RIEGER, 1996).

13.2.1. Teste de liberação

Para este teste, as membranas sintéticas hidrofílicas de acetato de celulose (nitrato 70- 80% e acetato), com tamanho de poro de 0,45 µm foram colocadas sobre as células de difusão em contato com o meio receptor (7 mL de tampão fosfato pH = 7,4, contendo 1% de polissorbato 80 (polysorbate 80)). Sobre as membranas, foram adicionados 250 mg (dose infinita) das emulsões A 1 e B 1 contendo ácido alfa-lipóico. Os experimentos foram conduzidos

a 37± 0,2o C e a solução receptora constantemente agitada a 300 rotações por minuto (rpm). O

meio receptor foi coletado após 2, 4 e 8 horas e a concentração de ácido alfa-lipóico foi determinada por espectrofotometria UV no comprimento de onda de 334 nm. Este experimento foi realizado seis vezes utilizando as emulsões base A e B como branco.

Para a elaboração da curva analítica para a quantificação da concentração em mg/mL do ácido alfa lipóico nos testes de liberação e permeação foi preparada uma solução estoque com 200 mg de ácido alfa-lipóico padrão secundário (matéria prima) em 100 mL de solução tampão fosfato pH 7,4 contendo 1% de polissorbato 80 (tween 80), tendo sido obtida uma concentração da solução estoque de 2 mg/mL. A partir desta solução estoque, prepararam-se diluições obtendo as concentrações reais: 0,17396, 0,34881, 0,53538, 0,73834, 0,95121, 1,15338 e 1,36594 mg/mL. O coeficiente de regressão linear e a equação da reta foram determinados.

A quantidade em g/mL de ácido alfa-lipóico liberado para o meio foi determinado através da seguinte equação:

Q

= C

. V

+ Σ

.C

.V

(equação XVII)

Qreal (t) = quantidade real liberada no tempo t (horas); Ccalculada (t) = concentração calculada da coleta no tempo t;

Ca = concentração da amostra removida; Va = volume de amostra removido;

A quantidade liberada em g/mL de ácido alfa-lipóico calculada pela equação XVII foi dividida pela área de exposição para liberação, obtendo-se a quantidade liberada da substância ativa em g/cm2_.

A partir das curvas de liberação do ácido alfa-lipóico in vitro, a constante de velocidade da liberação da substância ativa para cada formulação foi calculada pela equação XVIII, descrita abaixo:

k = Δ[ ] / Δt

Em que,

Δ[ ] = variação da concentração de ácido alfa-lipóico em µg/mL entre o tempo final e o inicial; Δt = variação entre tempo final e o inicial.

O perfil de liberação das formulações estudadas foi avaliado matematicamente seguindo modelos de zero ordem, primeira ordem e pseudoprimeira ordem, através da determinação do coeficiente de correlação linear (R2_{) das curvas de liberação in vitro.}

13.2.2. Teste de permeação cutânea

Para a realização do teste de permeação cutânea, foi utilizada pele de orelha de porco (figuras 98 e 99), obtida do Frigorifico Olho D’água da cidade de Ipuã no estado de São Paulo. As orelhas inteiras e com pelo foram limpas e dermatomizadas imediatamente após a aquisição (Figura 100). As peles foram mantidas em temperatura a -5 ± 2° C e, após 24 horas, foram utilizadas para a realização do teste.

A pele de orelha de porco dermatomizada foi colocada sobre as células de difusão com a derme em contato com o meio receptor (7 mL de tampão fosfato pH = 7,4, contendo 1% de polisorbato (polysorbate 80)). No estrato córneo foram exatamente pesados e adicionados 270 mg da emulsão A 1 e exatos 265 mg da emulsão B 1 contendo ácido alfa-lipóico. Os

experimentos foram conduzidos a 37 ± 0,2o C e a solução receptora constantemente agitada a

300 rotações por minuto (rpm). O meio receptor foi coletado após 2, 4 e 8 horas respectivamente e a concentração de ácido alfa-lipóico foi determinada através de espectrofotometria UV. Este experimento foi realizado seis vezes e foram utilizadas como branco, as emulsões base A e B.

A quantidade em g/mL de ácido alfa-lipóico permeado para o meio foi determinado através da equação XVII, descrita no item 13.2.1 deste capitulo.

A quantidade permeada em g/mL de ácido alfa-lipóico calculada pela equação XVII foi dividida pela área de exposição para permeação, obtendo-se a quantidade permeada da substância ativa em g/cm2_.

A partir das curvas de permeação do ácido alfa-lipóico in vitro, a constante de velocidade da permeação da substância ativa para cada formulação foi calculada pela equação XVIII, descrita no item 13.2.1 deste capitulo.

O perfil de permeação das formulações estudadas foi avaliado matematicamente seguindo modelos de zero ordem, primeira ordem e pseudoprimeira ordem, através da determinação do coeficiente de correlação linear (R2) das curvas de liberação in vitro.

Figura 98. Pele de orelha de porco dessecada Figura 99. Pele de orelha preparada para dermatomização

Figura 100. Pele de orelha de porco dermatomizada e cortada no tamanho adequado para a realização do ensaio de permeação cutânea.

A quantidade em g/mL de ácido alfa-lipóico permeado para o meio foi determinado através da equação XVII já descrita no item 13.2.1

O perfil de permeação das formulações estudadas foi avaliado matematicamente seguindo modelos de zero ordem, primeira ordem e pseudoprimeira ordem, através da determinação do coeficiente de correlação linear (R2) das curvas de liberação in vitro.

13.2.3. Teste de retenção no estrato córneo

No final de cada experimento, as peles foram removidas das células de difusão e o excesso de formulação presente nas peles foi removido com água destilada e secas com papel absorvente. As peles foram fixadas em superfície plana, a área de retenção para a remoção do estrato córneo foi delimitada e o estrato córneo foi removido através do método de tape stripping, que consiste em 12 batidas com fitas adesivas sobre a pele fixada. A primeira fita foi descartada para retirar o excesso da formulação sobre a pele e as 11 fitas restantes foram transferidas para tubos de ensaio contendo 4 mL de metanol (PA) e agitados em agitador por 1 minuto. Em seguida, os tubos foram sonicados por 15 minutos em banho de ultrassom. O sobrenadante foi analisado por espectrofotometria UV no comprimento de onda de 333 nm adaptando a metodologia descrita por (CASAGRANDE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007).

13.2.4. Teste de retenção na epiderme/derme

Para a realização deste teste, todas as peles sem o estrato córneo foram cortadas com tesoura e transferidas para tubos Falcon contendo 4 mL de metanol e foram sonicados durante 30 minutos. A solução final foi analisada para quantificação do ácido alfa-lipóico retido nas camadas de epiderme e derme por espectrofotometria UV (CASAGRANDE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2007).

Para a elaboração da curva analítica para a quantificação do ácido alfa lipóico no teste de retenção estrato córneo e epiderme/derme foi preparda uma solução estoque com 200 mg de ácido alfa-lipóico padrão secundário (matéria prima) em 1oo mL de metanol (PA) obtida uma concentração estoque de 2 mg/mL. A partir desta solução estoque, foram preparadas diluições nas concentrações reais de: 0,17396, 0,34881, 0,53538, 0,73834, 0,95121, 1,15338 e 1,36594 mg/mL. O coeficiente de regressão linear, e a equação da reta foram determinados.