Métodos para cultivo celular

4.2.1 Preservação celular

Para a preservação, as células foram depositadas em tubos

criogênicos e mantidas em nitrogênio líquido a -196°C. No processo de congelamento, as células foram retiradas das culturas na fase de crescimento

exponencial e centrifugadas a 1600 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em meio de congelamento, e depositadas a uma densidade de 3.106 cel.mL-1 em cada criotubo. Em seguida estes foram colocados em um recipiente contendo álcool isopropílico, específico para condicioná-los, e levados a um ultrafreezer durante 24 horas (h), de forma a proporcionar uma taxa de congelamento constante de -1°C por minuto. Após esse período, os vails contendo as células foram armazenados em nitrogênio líquido.

4.2.2 Descongelamento e ativação celular

No processo de descongelamento das células, cada tubo criogênico foi retirado do nitrogênio líquido e mantido à temperatura ambiente até o descongelamento. Logo após, a suspensão de células foi transferida para um tubo falcon de 15 mL contendo 9 mL de meio de cultura e centrifugada a 1600 rpm (centrífuga Excelsa Baby I, modelo 206, da FANEM - Brasil) por 5 minutos. O meio de cultura foi descartado para remoção do DMSO, o pellet de células ressuspendido em 1 mL de meio de cultura e transferido para frasco T de 75 cm2 contendo 14 mL de meio de cultura. Todas as manipulações realizadas com as células ocorreram em uma câmara asséptica Sterilgard III de fluxo laminar, classe II, da Baker Company (EUA), modelo SG403/SG603, provida de lâmpada germicida de UV.

4.2.3 Cultivo estático em frascos T

Após o descongelamento e ativação, as células foram mantidas em frascos T de 75 cm2 de área superficial em incubadora a 37°C e 5% de CO2 até que a confluência de aproximadamente 80% foi atingida. Iniciou-se então o procedimento de passagem das células de uma garrafa para outras. O sobrenadante foi retirado e

as células foram lavadas com 10 mL de solução de PBS. Em seguida, foram adicionados 4 mL de solução de TrypleTM e mantidos por 5 minutos em incubadora a 37°C para que as células fossem desaderidas da superfície do frasco T. A ação da enzima foi interrompida após a adição de 12 mL de meio de cultura. O conteúdo do frasco T (células, meio de cultura e TrypleTM) foi transferido para um falcon e centrifugado a 1600 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em meio de cultura. Retirou-se uma alíquota de 60 µL para a contagem utilizando-se o método de exclusão do corante azul de tripan (descrito no item 4.3.1). Em seguida inoculou-se 1.106 células em cada nova garrafa de 75 cm2 contendo 15 mL de meio de cultura.

Esse procedimento foi repetido até a obtenção da densidade celular necessária para o inóculo no frasco spinner. Durante a expansão, a morfologia celular foi observada com a utilização de um microscópio invertido modelo CK30 da marca Olympus (Japão).

4.2.4 Procedimento experimental para cultivo em frasco spinner

A expansão das hMSC-TERT em frasco spinner foi realizada posteriorente aos processos de descongelamento e cultivo estático em frascos T. A Figura 12 mostra a sequência dessas três etapas ao longo de todo o cultivo.

Figura 12 - Representação dos procedimentos realizados para a expansão de hMSC-TERT em

frasco spinner com impelidor de vidro.

Aproximadamente entre 48 h e 24 h antes do início do experimento, o

frasco Spinner foi preparado aplicando-se 1 mL de Sigmacote® em suas paredes internas a fim de impedir a adesão das células no frasco (como descrito no item 4.1.7) e em seguida foi esterilizado em autoclave. Os microcarregadores também foram preparados com antecedência. Foram pesados 0,150 g do microcarregador Cultispher (3,0 g/L) em um falcon, adicionou-se 7,5 mL de PBS (50mL/g), e esse conteúdo foi levado para a autoclavagem. Após a esterilização, na câmara de fluxo laminar, o PBS foi descartado, adicionou-se 10mL de meio de cultura α-MEM e os microcarregadores foram reservados na geladeira até o momento do inóculo no spinner.

Após a obtenção do número de células suficiente para o início do experimento (6,25x106 células), as células foram transferidas para o frasco spinner. Primeiramente adicionou-se o meio de cultura, em seguida os microcarregadores e depois o inóculo filtrado (membrana de 100 µm de poro, BD Biociences, EUA) contendo as células. O volume total de trabalho foi de 50 mL para todos o experimentos. O frasco spinner foi mantido ao longo do cultivo em incubadora a 37°C e 5% de CO2, como pode ser visto na Figura 13.

Figura 13 – Imagem do spinner com impelidor de vidro dentro da incubadora durante o cultivo de hMSC-TERTs.

(Acervo pessoal)

O cultivo em frasco spinner foi dividido em duas fases: a fase para a adesão e a fase para a expansão celular ou de crescimento. Na fase de adesão, durante as 8 primeiras h, aplicou-se uma agitação de 50 rpm por 30 segundos a cada 15 minutos. Após esse período aumentou-se 10 rpm de agitação a cada 2 h a partir de 20 rpm até atingir 12 h de cultivo. Na fase de expansão, a agitação foi mantida constante a 40 rpm e foi feita a troca de 50% do volume de trabalho (25 mL), a partir de 24 h, com o objetivo de evitar o esgotamento de nutrientes, diluir os metabólitos considerados tóxicos (amônia e lactato) e evitar valores de pH nocivos às células.

A fim de acompanhar o desenvolvimento do cultivo, após 24 h foram retiradas amostras de 8 em 8 h para verificar o pH no medidor da Denver (EUA), modelo UB10. Foram retiradas diariamente amostras de 2 mL. O sobrenadante dessas amostras foi separado dos microcarregadores por meio de um filtro (membrana de 100 µm de poro, BD Biociences, EUA), que foi acoplado na ponta da pipeta. Os microcarregadores foram ressuspendidos no mesmo volume (2 mL) de meio de cultura α-MEM (CULTILAB, Brasil) sem o indicador vermelho de fenol. Do sobrenadante separado, reservou-se 1 mL para a análise de amônia, 250 µL para análise de carboidratos, 250 µL para a análise de aminoácidos e 40 µL para a quantificação das células livres em suspensão (vide item 4.3.1). Esses volumes foram congelados para a posterior realização dessas análises descritas nos itens 4.3.4, 4.3.5 e 4.3.6, exceto o volume para quantificação celular da suspensão, que foi realizado imediatamente após a separação do sobrenadante. Foram reservados ainda 500 µL da amostra (microcarregadores com células ressuspendidos em meio de cultura sem vermelho de fenol) para a aplicação da metodologia do MTT (vide item 4.3.2) e 500 µL para a quantificação das células recuperadas (desaderidas) dos microcarregadores por meio da enzima tryple 10X (vide item 4.3.3). O restante da amostra foi utilizado para obtenção das imagens de microscopia ótica (vide itens 4.3.8 e 4.3.9).

No final de cada cultivo, as células foram desaderidas por meio de Tryple 10X e congeladas para que posteriormente pudessem ser utilizadas na análise de citometria de fluxo (vide item 4.3.7).