Métodos Serológicos

O diagnóstico de LCan pode ser feito através da deteção de anticorpos específicos (IgG) no soro, estando várias técnicas de diagnóstico disponíveis para o efeito (Solano-Gallego et al., 2009). Em geral, com estes métodos são obtidas boas sensibilidades e especificidades, no entanto, estas características dependem muito dos antigénios utilizados (Maia & Campino, 2008).

Os elevados títulos de anticorpos estão geralmente associados a doença e a uma densidade parasitária elevada (Solano-Gallego & Baneth, 2008), mas alguns cães permanecem seronegativos durante períodos variáveis depois de terem sido infetados por Leishmania. A seroconversão ocorre no período de alguns meses desde a infeção, em média 5 meses (intervalo: 1-22) para infeções naturais e 3 meses (intervalo: 1-6) para experimentais (CLWG, 2007). Portanto, um título de anticorpos altamente positivo apoia fortemente o diagnóstico e é conclusivo de LCan com sinais clínicos ou alterações clínico- patológicas compatíveis. Nos casos de títulos baixos de anticorpos e sinais clínicos compatíveis, os métodos adicionais de deteção, tais como a citologia, histopatologia e PCR, orientam a exclusão ou confirmação da doença, porque um resultado positivo de baixo título pode ser detetado em cães que sejam portadores subclínicos (Greene, 2012). Os resultados falso positivos, devido à reatividade cruzada (Trypanosoma cruzi ou outras espécies de Leishmania), são improváveis na Europa. São menos prováveis de ocorrer quando se utilizam péptidos recombinantes (Bourdeau, 2009).

Vários métodos serológicos têm sido desenvolvidos, incluindo a IFI, a aglutinação direta, a hemaglutinação indireta, a contraimunoelectroforese, a imunocromatografia rápida, os testes de fixação do complemento, vários tipos de ensaios imunoenzimáticos (ELISA, ELISA de competição, Dot- ELISA, slide-ELISA) e o Western Blot (Pereira da Fonseca & Villa de Brito, 2008). Destes, os mais utilizados são o teste de imunocromatografia rápida, as técnicas de

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e o teste de imunofluorescência indireta (IFI) (Canine Leishmaniasis Working Group [CLWG], 2007).

A IFI é executada através da colocação de soro de animais suspeitos, em série de diluições, em lâminas revestidas com promastigotas de L. infantum. A ligação específica do antigénio ao anticorpo, e a concentração relativa (titulo de anticorpo), são revelados pelo uso de anticorpos conjugados fluorescentes. A avaliação da intensidade de fluorescência por microscopia é subjetiva em títulos baixos positivos, o que é um limite do ensaio. Devido à sua elevada sensibilidade e especificidade este teste é recomendado pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) como método serológico de referência. A titulação de anticorpos por IFI é útil na distinção de cães infetados subclínicos, que geralmente têm títulos baixos e dos animais doentes, que geralmente têm títulos elevados. No entanto, não há consenso entre os laboratórios no limiar do título IFI, o qual pode variar de 1:40 a 1:320 (Gramiccia, 2011). A sensibilidade da IFI na deteção de cães infetados varia entre 21,6% a 100%. Num estudo, em que foram testados cães sintomáticos e assintomáticos de uma área endémica, a sensibilidade e especificidade foram de 85,5% e 94,7%, respetivamente. Este teste, que utiliza como antigénio o parasita inteiro, é útil em estudos epidemiológicos, na prática clínica e também no seguimento do tratamento (Maia & Campino, 2008).

No diagnóstico por ELISA, o soro em avaliação é colocado em microplacas revestidas por antigénios de Leishmania. Nos casos positivos ocorre uma reação colorimétrica que pode ser quantificada por espectrofotometria, não sendo dependente de variáveis relacionadas com o operador. Este é um teste específico com uma sensibilidade média-alta (70-100%). No entanto essa sensibilidade e especificidade dependem muito dos antigénios utilizados, que incluem principalmente extratos de promastigota solúveis e proteínas recombinantes ou purificadas (Miró et al., 2008). A utilização de extratos de parasita inteiros aumenta a sensibilidade na deteção de infeções subclínicas ou clínicas, mas com uma especificidade ligeiramente inferior. Por outro lado, o teste ELISA realizado com peptídeos recombinantes é muito específico, mas dependendo do antigénio utilizado, pode faltar sensibilidade na deteção de cães infetados clinicamente saudáveis. Um teste ELISA, baseado em antigénios recombinantes (sub-epítopos K9, K26 e K39), mostrou elevada especificidade e sensibilidade em cães infetados (Solano-Gallego et al., 2009). Os testes ELISA são úteis para análises laboratoriais ou em aplicações de campo e para fazer a triagem de um grande número de amostras num curto período de tempo uma vez que podem ser realizados de forma simples e podem ser facilmente adaptados para o uso com diversos antigénios tais como citoplasmáticos inteiros, antigénios purificados, péptidos sintéticos definidos e proteínas recombinantes (Maia & Campino, 2008).

Ensaios baseados em imunocromatografia são fáceis de usar, com tempos de resposta muito rápidos, permitindo a intervenção imediata do médico veterinário, fornecendo resultados qualitativos no local. Estes testes têm geralmente boa especificidade, mas a sua

sensibilidade é variável e o seu desempenho ainda não é ótimo. Várias apresentações de testes rápidos e preparações antigénicas para IFI e ELISA estão também disponíveis comercialmente (Solano-Gallego et al., 2009). Embora possuam especificidade média-alta, a sensibilidade pode situar-se entre 30% a 70%, sendo o principal problema a ocorrência de resultados falso-negativos (Oliva et al., 2010).

Os resultados serológicos devem ser sempre correlacionados com características clínicas e alterações laboratoriais antes que seja possível fazer um diagnóstico definitivo da Leishmaniose, uma vez que não tem sido observada nenhuma correlação direta entre títulos serológicos e a severidade dos sinais clínicos. A titulação serológica tem pouco valor como um marcador para a monitorização do tratamento, mas o título negativo no final do tratamento é um indicador valioso, e o reaparecimento de seroconversão é uma indicação precoce de uma recaída (Ciaramella & Corona, 2003a).

Embora a produção de anticorpos seja baixa quer nas fases inicial e tardia, quer em infeções assintomáticas, os cães infetados desenvolvem geralmente títulos de anticorpos que aumentam gradualmente ao longo do tempo (Maia & Campino, 2008). No entanto, a presença apenas de anticorpos anti-Leishmania não é um sinal conclusivo de doença. Portanto, é aconselhável realizar mais do que um teste serológico, para melhorar o diagnóstico de LCan e para continuar a monitorização com testagem repetida a cada 3 meses (Maia & Campino, 2008).