Existem diferentes métodos para quantificar os coliformes totais e fecais nas amostras coletadas, descritos em diversas publicações internacionais e nacionais, considerados como referências (FRANCO et al., 2008). O mais utilizado é o método tradicional de tubos múltiplos, que estima aproximadamente o número de microrganismos presentes na amostra original denominado “Numero Mais Provável” (NMP), porém este método é laborioso e demorado envolvendo uma etapa presuntiva e duas confirmativas levando pelo menos 96 horas para sua realização (LEITE et al., 2006) .
Esta metodologia foi desenvolvida há muitos anos atrás e é empregada como padrão oficial em diversos laboratórios no mundo inteiro, por ser amplamente preconizada pela Vigilância Sanitária e outros órgãos regulamentadores (FRANCO et al., 2008). Recentemente, métodos mais rápidos vêm sendo desenvolvidos como forma alternativa para os métodos convencionais (HUNT et al., 2005) e dependendo do método utilizado, a sensibilidade e especificidade são ainda maiores que a dos convencionais (FRANCO et al., 2008).
Estes métodos são baseados na tecnologia de substratos específicos marcados com indicadores cromogênicos e/ou fluorogênico onde a incorporação desses substratos em um meio seletivo elimina a necessidade de subcultivos e posteriores testes para identificação de certos microrganismos (MANAFI, 2001). No entanto, além de estimar mais rapidamente a qualidade bacteriológica da amostra devem dar resultados reais e ter sensibilidade igual aos métodos convencionais utilizados rotineiramente para a análise do mesmo microrganismo (HUNT et al., 2005)
2.6.1 Método da fermentação dos tubos múltiplos
Neste método o meio de cultura utilizado, é específico para cada microrganismo (SILVA et al., 2005; FRANCO et al., 2008) e é realizado em três etapas. A primeira etapa é a presuntiva, onde uma alíquota da amostra é inoculada em caldo lauril sulfato triptose (LST), que inibe a microbiota acompanhante e, ao mesmo tempo é um meio de enriquecimento seletivo para bactérias do grupo dos coliformes totais e termotolerantes (SILVA et al., 2005).
As bactérias deste grupo causam turvação no meio com formação de gás, detectado através de tubos de Durham invertidos, após 48 horas de incubação a 35 ± 2 ºC.
A segunda etapa é a confirmativa para a confirmação de coliformes totais também é realizada a inoculação de alçadas do caldo lauril positivo em caldo Verde Bile Brilhante (VBB), que apresenta em sua formulação sais biliares, que inibe o crescimento de microrganismos gram positivos, e a lactose, que é utilizada como substrato para a produção de gás pelos coliformes. A positividade neste teste é indicada pela turvação do meio e a produção de gás no tubo de Durham invertido após 48 horas de incubação a 35 + 2 ºC (HAJDENWURCEL, 1998), também é realizada a inoculação de alçadas do caldo lauril positivo em caldo EC Broth que é seletivo para microrganismos gram positivo devido à presença de sais biliares (FORSYTHE, 2002). Após incubação a 44,5 ºC no período de 24 a 48 horas, ocorre turvação do caldo EC com formação de gás, quando positivos para coliformes fecais (ROMPRÉ et al., 2002) uma vez que eles apresentam a capacidade de fermentar lactose com produção de gás à temperaturas mais elevadas (HAJDENWURCEL, 1998).
A terceira etapa é a confirmativa adicional, os tubos de caldo EC positivos são homogeneizados e uma alçada é semeada em placas de ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) para a confirmação de E. Coli que formam colônias púrpuras com centro preto e brilho metálico verde, pois este meio de cultura é um meio diferencial utilizado para o isolamento e detecção de Enterobacteriaceae ou bacilos coliformes relacionados, com base na fermentação de lactose (KONEMAN et al., 2001)..
Por esta técnica são considerados coliformes aqueles microrganismos que forem capazes de fermentar lactose nos testes presuntivos e confirmativos, com produção de gás a 35 +2 °C e a 44 ±1 ºC (BRASIL, 2007).
2.6.2 Métodos rápidos de identificação
A rápida identificação de microrganismos tornou-se necessárias e novas técnicas foram desenvolvidas a partir da década de 70 para facilitar a rapidez de diagnóstico.
As pesquisas levaram ao desenvolvimento dos meios cromogênicos e fluorogênicos, onde as colônias de microrganismos alvo, dependendo da enzima que atua sobre o substrato presente, adquirem cores e/ou fluorescência características capazes de promover seu
reconhecimento (TSORAEVA et al., 2005) e diversos métodos para identificação de microrganismos foram desenvolvidos (MANAFI, 2000).
Segundo Bastholm et al. (2008) e Nikaeen et al. (2009), a bioluminescência baseada em atividade enzimática, que é específica para cada grupo microbiano, pode reduzir potencialmente o tempo de análise de bactérias indicadoras.
2.6.2.1 Substratos cromogênicos
O uso de técnicas com substratos cromogênicos permite determinar simultaneamente coliformes totais e coliformes fecais presentes nas amostras alvo, utilizando apenas um meio de cultura, representando grande vantagem pela rapidez do resultado e a possibilidade de correção de problemas existentes, principalmente em sistemas de abastecimento público (MERCK, 2009).
O substrato cromogênico utilizado nesses métodos é orto-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo (ONPG) e “Salmon-GAL”. Nesse meio de cultura a ß-D-galactosidase, enzima específica de bactérias coliformes hidrolisa o composto "Salmon-GAL", que faz parte da mistura cromogênica. O produto da hidrólise é um composto corado de vermelho que faz as colônias de bactérias coliformes aparecerem na cor vermelha (MERCK, 2009).
A ß-D-glucuronidase, enzima específica de E. coli hidrolisa o composto "X- glucuronide", que faz parte da mistura cromogênica (SILVA et al., 2005), como E. coli faz parte do grupo de bactérias coliformes, possui também a ß-D-galactosidase, que hidrolisa conjuntamente o composto "Salmon-GAL e o ONPG promovendo a alteração na cor da colônia para roxo devido à mistura dos cromogenios vermelho e azul, para isso acontecer é necessário um período de incubação de 18 a 28 horas a 35ºC após inoculação da amostra (OLSTADT et al., 2007).
2.6.2.2 Substratos fluorogênicos
O caldo Fluorocult é um caldo de enriquecimento seletivo para a detecção simultânea de coliformes totais e E. coli em amostras liquidas e sólidas (MERCK, 2009). A alta
qualidade nutricional do fosfato incorporado ao caldo garante uma alta velocidade de crescimento dos coliformes presentes, enquanto o lauril sulfato inibe o crescimento em larga escala das bactérias Gram positivas. A adição do substrato cromogênico 5-bromo-4-cloro-3- indolil-b-D-galactopiranosídeo (X-GAL), o qual é clivado pelos coliformes, e o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-b-D-glicuronídeo (MUG), que é altamente solúvel em água, sensível e específico para E. coli, torna possível a detecção simultânea de coliformes totais e
E. coli.
A presença de coliformes é indicada pela cor azul-verde do caldo, e E. coli pela fluorescência azul sob luz UV de comprimento de onda longo. A reação Indol posterior confirma a presença de E. coli. Esta reação fica aumentada devido à concentração de triptofano no caldo. A enzima síntese é amplificada pelo 1-isopropil-b- D-1-tio- galactopiranosídio (IPTG), e a atividade da -b-D-galactosidase é aumentada (TRONCO, 2010). Este método proporciona um resultado em até 24 h de incubação (MERCK, 2007).
De acordo com Olstadt et al., 2007 nos últimos anos vários métodos para detecção simultânea de coliformes totais e E. coli tem sido desenvolvidos e aprovados pelos órgãos responsáveis para a analise de água. Na década de 90 foram aprovados pela United States Environmental Protection Agency (USEPA) os métodos Colilert, Colilert-18 e Colisure. Recentemente, outros sete métodos foram aprovados, o MI Ágar (USEPA Federal Register 1998), m-Coli Blue 24, E*Colite (USEPA Federal Register 1999), Chromocult (US EPA Federal Register 2002) Readycult Coliforms 100, Colitag (USEPA Federal Register 2004) e Coliscan (USEPA Laboratory Certification Manual 2005).
2.7 Alternativas tecnológicas para mitigar o potencial poluidor por microrganismos