Malária de roedores – Plasmodium berghei 52

Há 40 anos, em 1976, foi estabelecida pela primeira vez uma cultura de células contínua de Plasmodium de humanos (Trager and Jensen, 2005) e de P. berghei de roedores em 1985 (Mons et al., 1985;Ramaiya et al., 1987). Até então, as culturas eram de curta duração ou em modelos biológicos animais (Freire, 1892). A otimização das técnicas de cultivo permitiu que grupos de pesquisa lançassem mão de estudos que ampliassem o conhecimento sobre a biologia da malária.

De forma similar, o desenvolvimento de tecnologia de cultivo celular em modelos animais avança o conhecimento da biologia dos parasitas humanos em perspectivas de estudos que ainda não podem ser endereçadas a técnicas in vitro.

Não obstante, o estudo dos parasitas da malária humana pelo expediente de parasitas de roedores são oportunos para avançar o conhecimento sobre biologia do desenvolvimento de parasitas da malária, interações parasito-hospedeiro, desenvolvimento de vacinas e testes de drogas. Cuidadosa avaliação dos resultados de modelos de roedores é essencial para avaliar a sua relevância para a doença humana.

Na malária humana, causada por P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P.

knowlesi, frequentemente se é empregado Plasmodium berghei como modelo biológico. As

similaridades estão em nível fenotípico e na biologia (Sanni et al., 2002), como na gametocitogênese, ativação de gameta, exflagelação, fertilização, formação do zigoto, formação de oocineto (Guttery et al., 2012b), sincronização, taxa de síntese do DNA e momento de replicação do material genético extra-nuclear (van Dijk et al., 1997).

P. berghei foi provavelmente visualizado pela primeira vez há pouco mais de 70 anos,

em 1943, por Vincke, pela observação de esporozoítos em glândulas salivares (Landau and Boulard, 2012;Vanderberg and Gwadz, 2014) e, em 1946, por esfregaços de sangue do estômago de mosquitos Anopheles dureni millecamps, seu hospedeiro invertebrado na natureza (Sinden et al., 2002). Grammomys surdaster, uma espécie de roedor encontrado na floresta próxima à cidade de Kisanga, no país de Catanga, é seu hospedeiro vertebrado (Bafort et al., 1968;Sinden et al., 2002).

Esse organismo propicia um modelo atraente para a pesquisa sobre malária, pois é capaz de produzir em laboratório todas as formas sexuadas e assexuadas, o que permite uma infinidade de estudos e a comparação dos dados in vivo e in vitro (Sanni et al., 2002;Briquet et al., 2015). O organismo é utilizado em rotina por laboratórios e projetos de pesquisa, o que aproxima alguns padrões de comparação entre estudos. Podem ser usados vetores particulares de diversas regiões do mundo (Tabela 1). Seu genoma, mitocondrial e do apicoplasto, já foi sequenciado.

Tabela 1: Relação de mosquitos com capacidade vetorial e mosquitos sem capacidade para transmissão de P. berghei (Sinden et al., 2002).

Com Capacidade Vetorial Sem Capacidade Vetorial

An. dureni Culex bitaeneorhynchus

An. stephensi mysorensis Ae. aegypti*

An. gambiae An. aztecus

An. atroparvus An. concolor

An. quadrumaculotus An. coustani var ziemanni

An. maculipennis An. fluviatilis

An. albimanus An. funestus

An. hyrcanus

An. jamesi

An. pulcherrimus

An. splendidus

An. subpictus

* – produz até o oocisto da linhagem SP28 S. Keiberg.

Não obstante as possibilidades de abordagens de pesquisa e a base de conhecimento já construída sobre a doença em humanos e sobre Plasmodium berghei, o emprego do modelo para estudo das malárias é oportuno pela existência e disponibilidade de linhagens de camundongos suceptíveis, geneticamente definidos e nocauteados (Janse et al., 2006).

Existem clones de P. berghei bem caracterizados, com fenótipos particulares como para expressão de proteínas fluorescentes (Natarajan et al., 2001;Franke-Fayard et al., 2004) ou pela incapacidade de gerar estágios sexuais.

54 Algumas linhagens de P. berghei isoladas desconhecidas são K173, ANKA, LUKA, SP11 e NK65 (Sinden et al., 2002). Este trabalho utiliza-se da linhagem P. berghei NK-65 e do banco de dados da linhagem ANKA.

A designação NK-65 tem origem de “New York-Kisanga 1965”. Este é o nome em que consta local do isolamento, local de origem e data do isolamento. A linhagem foi isolada em 1965 a partir de mosquitos Anopheles dureni, infectados por P. berghei, capturados na floresta de Kisanga, em Catanga, e enviados pelo pesquisador belga, Josef Maria Bafort. O plasmódio foi isolado e replicado na Escola Medica da Universidade de Nova Iorque (Vanderberg and Gwadz, 2014).

P. berghei ANKA foram também capturados por Bafort e Vincke na floresta de

Kasapa, próxima de Lubumbashi, na data de Março de 1965. A designação advem de obtidos de mosquitos coletados na floresta de Antwerp-Kasapa. O plasmódio foi isolado e replicado no Prince Leopold Institute of Tropical Medicine Antwerp em Antwerp (Vincke and Bafort, 1968;Vanderberg and Gwadz, 2014).

P. berghei tem por ponto forte a plasticidade para manipulações genéticas para estudo

da malária humana e um rápido ciclo de vida para maturação e diferenciação das formas sexuais (Guttery et al., 2012b). Ciclos reprodutivos do P. berghei são de curta duração quando comparados com de outras espécies plasmodiais, incluindo o P. falciparum. Todas fases de desenvolvimento no roedor hospedeiro permanecem circulantes no sangue.

Em laboratórios, a fase sexual de P. berghei é com frequência realizada em mosquitos

An. stephensi. Esporozoítos tornam-se maduros na glândula dos mosquitos com cerca de 13 a

14 dias após a infecção do mosquito e tem tamanho médio de 11 a 12 µm.

A fase do fígado é de curta duração. Ela se inicia com no mínimo 3 h após infeção (Frevert et al., 2005), para que suceda a infecção de hepatócitos, e transcorre por cerca de 50 horas para que conclua o ciclo assexuado hepático. Este ciclo culmina com a formação de formas esquizontes com o máximo de 30 µm que liberarão merozoítos para a próxima fase reprodutiva (Killick-Kendrick, 2012).

Ao fim do ciclo hepático, merozoítos são liberados no sistema circulatório e infectarão hemácias e, preferencialmente, reticulócitos de roedores hospedeiros (Rénia et al., 2012). Os

ciclos assexuados eritrocitários têm duração aproximada de 24 horas sem sequestração tecidual. Os gametócitos são formados a partir de ciclos assexuados eritrocitários.

Algo próximo de 20% de merozoítos de cada ciclo assexuado eritrocitário dão origem a gametócitos (Jambou et al., 2011). O tempo de desenvolvimento dos gametócitos até se tornarem maduros é de cerca de 30 horas. Ao término de seu desenvolvimento, as células apresentarão um tamanho de 15 µm (Garnham, 1965) e fase de crescimento G0 até serem ingeridas ou ocorrer a morte do hospedeiro (Sinden, 2012).

Após ingestão e ativação dos gametócitos por mosquitos, a diferenciação celular em gametas finda em aproximadamente 15 minutos e, portanto, o plasmódio encontra-se competente para a fertilização do zigoto. O zigoto, com cerca de 12 µm, replica seu DNA e diferencia-se em uma célula móvel e tetraploide de cerca de 12 µm (Garnham, 1965).

Para que a infecção tenha êxito com ao menos um oocisto, deverão ser formados entre 40-140 oocinetos (Sinden et al., 2007). A transição de oocineto para oocisto depende da densidade do primeiro, da resposta imunológica do mosquito (Sinden et al., 2007), de variáveis fisiológicas, bióticas e genotípicas dos organismos (Christophides et al., 2002;Lambrechts et al., 2005;Dong et al., 2006). Contudo, uma vez que o desenvolvimento de oocineto para oocisto tenha sucesso, ele acontecerá em média dentro de 18 a 24 horas.

Um oocisto maduro tem média de tamanho de 45µm (Killick-Kendrick, 2012) e libera uma média de 2000 esporozoítos imaturos por oocisto na hemocele do mosquito (Stone et al., 2013) em cerca de 18 dias após a infecção (Stone et al., 2013). Dentre os esporozoítos liberados em An. gambiae e An. stephensi, cerca de 20-60% (Hillyer et al., 2007;Stone et al., 2013) são capazes de invadir glândulas salivares após 8 horas de sua liberação pelo oocisto (Hillyer et al., 2007). O paradeiro dos esporozoítos que não conseguiram invadir é desconhecido; sabe-se apenas que 2% sofrem fagocitose, morte e degradação celular (Hillyer et al., 2007).

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