DESI Fotomultiplicador Multiplicador eletrônico
Experimentos de um único estágio de análise (full scan) (MS) e experimentos com dois ou mais estágios de análise (tandem) (MSn) contribuem imensamente para o estudo de biomoléculas. Arranjos com mais de um analisador em equipamentos modernos permitem experimentos valiosos para estas situações. A determinação da seqüência de aminoácidos tem sido usada para a elucidação da estrutura primária de peptídeos incluindo situações envolvendo misturas complexas (DANIEL, FILHO, 2007, GRIFFITHS et al., 2001, HOFFMANN, 1996).
Muitas biomoléculas não podem ser ionizadas pela técnica clássica de ionização por impacto eletrônico (EI), técnica muito utilizada para moléculas voláteis porque os compostos são volatilizados em um estado inicial e em seguida ionizados, tornando desta forma o método limitado para compostos termicamente estáveis com baixo peso molecular ((DANIEL; FILHO, 2007, GRIFFITHS et al., 2001).
Uma das técnicas de ionização mais utilizadas atualmente é por “electrospray” (ESI) (YAMASHITA; FENN, 1984). A ionização por “electrospray” é uma técnica suave e pode gerar íons multiplamente carregados, com número de cargas elevado, o que possibilita a análise de compostos com elevada massa molecular como peptídeos, proteínas, nucleotídeos, polímeros sintéticos em inúmeros detectores por reduzir a razão m/z. Como o analíto a ser analisado deve estar em solução, isso permite com que a técnica seja utilizada acoplada com inúmeras outras técnicas de separação e ou elucidação estrutural (CLAE, RMN) (GREER; MORRIS, 2008).
A Figura 10 ilustra uma fonte de ionização por ESI. A amostra em solução é introduzida na fonte de ionização através de uma sonda (probe) que possui em sua extremidade um capilar de aço inoxidável de 100 μm de diâmetro interno, a uma vazão de fase móvel que pode variar entre 1 e 1000 μL/min e sob temperatura que pode variar de 200 a 550°C. A aplicação de um potencial de voltagem que pode variar de 2 a 5 kV no capilar provoca a ionização das moléculas em solução gerando íons ânions [M-H]- (molécula deprotonada), no caso de operar no modo electrospray negativo (ESI-) e íons cátions [M+H]+ (molécula protonada) no caso de operar no modo electrospray positivo (ESI+). No modo ESI+ é freqüente notar a presença de íons [M+Na]+, [M+K]+ e [M+NH4]+que são designados íons aduto. No caso [M+Na]+ é o
aduto de sódio, [M+K]+ o aduto de potássio e [M+ NH4]+ o aduto de amônio. No modo ESI- é
possível notar a presença do aduto com cloro [M+Cl]-. Os íons saem do capilar e são acelerados com a ajuda de um gás nebulizador (geralmente N2) na direção de um anteparo. A aplicação de
Coulombica (Figura 10) faz com que íons de cargas opostas sejam atraídos para dentro de sistema em alto vácuo e os íons de mesma carga sejam repelidos (SOUZA, 2010).
Estes e outros parâmetros que devem ser cuidadosamente escolhidos a fim de garantir a eficiência do processo de ionização e, desta forma, permitir que o espectro de massas gerado contenha informações de interesse do analista são conhecidos como os ajustes finos (tuning), que devem ser realizados por um operador que possua experiência na técnica.
G ás d e ne bu liz aç ão (N 2 ) Fluxo proveniente de técnica acoplada
Fonte de ionização por ESI
Capilar Analisador de massas Extrator Cone Pressão atmosférica Anteparo Molécula do analíto
Aerossol de gotas carregadas com múltiplas cargas
evaporação Explosão Coulombica [M+H]+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Figura 10. Eventos que ocorrem na fonte de ionização por ESI de um espectrômetro de massas.
Inúmeros experimentos podem ser selecionados em equipamentos com diferentes analisadores, a fim de obter dados que permitam elucidar a estrutura de uma molécula. Estes experimentos, para arranjos em triplo quadrupolo, que estão ilustrados na Figura 11 são:
Full scan: o primeiro analisador permite a transmissão (separando pela razão m/z)
de todos os íons gerados na fonte de ionização. A célula de colisão e o segundo quadrupolo estão inativos funcionando apenas como lentes para focarem e acelerar os íons até o detector.
Íon precursor (parent ion scanning): o primeiro analisador permite a transmissão (separando pela razão m/z) de todos os íons gerados na fonte de ionização com razão m/z acima
do íon o qual está sob investigação. Estes íons são fragmentados na célula de colisão com gás inerte (geralmente argônio) e os fragmentos são analisados no segundo analisador do equipamento. Este experimento é útil para verificar se um dado fragmento foi gerado por um ou mais íons específicos.
Íon produto (product or daughter ion scanning): o primeiro quadrupolo é programado para selecionar apenas os íons de razão m/z que estão sob investigação gerados na fonte de ionização. Estes íons específicos são encaminhados até a célula de colisão (hexapolo) onde são fragmentados e analisados pelo segundo quadrupolo. Todos os fragmentos decorrentes dos íons previamente selecionados no primeiro quadrupolo geram um padrão específico de fragmentação (impressão digital) de cada íon em análise.
Perda neutra (constant neutral loss scanning): neste tipo de experimento é selecionada um ou mais valores que correspondem a perda neutra previamente identificada pelo analista ao analisar os dados gerados no experimento de full scan. O segundo analisador opera de forma que somente íons que possuam a diferença em unidades de massa previamente selecionada pelo analista, daqueles que passaram pelo primeiro analisador sejam detectados. Este experimento é muito útil para confirmar a origem de fragmentos em amostras com pouca pureza ou identificar classes de compostos em extratos brutos.
Monitoramento seletivo de íons (selected reaction monitoring – SRM): o primeiro analisador permite a passagem de apenas íons de razão m/z selecionadas e estes são fragmentados na célula de colisão. O segundo analisador opera de forma igual ao primeiro permitindo a passagem de somente íons de razão m/z selecionados. Esta metodologia é muito empregada para confirmar a presença de um composto característico em uma matriz complexa como presença de anabolizantes ou drogas em amostras de sangue ou urina de atletas em testes antidoping.
Assim, a escolha da ionização por ESI para análises de peptídeos e proteínas, dentre outras classes de compostos, se destaca dos outros modos de ionização existentes pela compatibilidade de acoplamento com cromatografia líquida, compatibilidade de realização de experimentos em um ou mais estágios (MSn), sensibilidade de detectar amostras em concentrações baixas, formação de íons multiplamente carregados que permite com que estes sejam analisados em analisadores com baixo limite de detecção além de possibilitarem a aquisição de informações mais completas sobre a fragmentação dos íons em experimentos em mais de um estágio (TRAUGER, 2002).
MS1 Célula de colisão MS2