Mapeamento de epítopos pelo método de SPOT-synthesis

As proteínas BaP1, Leu-a e Atr-I foram mapeadas na busca de EpiLCB usando a metodologia SPOT síntese como descrita na seção de métodos usando pentadecapeptídeos e octopeptídeos sobrepostos por três resíduos cobrindo toda a sequência. Estas três proteínas foram sintetizadas na mesma membrana e esta foi exposta a soros IgG produzidos em camundongos. Foram usados três soros diferentes: Um soro IgG de camundongo anti-Atr-I altamente purificado (Schneider et al., 2014); Um soro policlonal IgG de camundongo anti-BaP1 de B. asper e outro soro policlonal IgG de camundongo anti-Leuc de B. leucurus. Estes soros foram testados contra a membrana contendo estas

proteínas. Portanto, foi possível mapear os peptídeos reconhecidos especificamente por cada soro contra as respectivas SVMPs alvo e também os peptídeos que mostrarem reatividade cruzada. Esta reatividade cruzada poderia ser causada pela similaridade destas proteínas que é até de 70% (Tabela 7). Assim a reatividade cruzada dos três soros foi avaliada frente a membrana contendo as três proteínas. Cada ponto o SPOT representa um peptídeo assim como descrito na metodologia. Estes pontos logo são avaliados manualmente atribuindo um valor de 0 até 5. Os SPOT de cor azul indicam reatividade frente aos anticorpos enquanto os amarelos ou marrons e em branco não (Martens et al., 1995, Frank et al., 1996). As diversas variações de coloração são causadas por vários fatores, idade da membrana, estado de conservação dos peptídeos sintetizados (Kramer et al., 1999, Weiser et al., 2005). Portanto um re-uso prolongado da membrana incrementa a possibilidade de erros nestas anotações. Esta metodologia tem sendo utilizada com sucesso para mapear EpiLCB (Duarte et al., 2010, Figueiredo et al., 2014). Os peptídeos correspondentes aos SPOTs de cor azul foram anotados como reativos e considerados como epítopos experimentais. É importante ressaltar que o soro anti- Atr-I somente mostro reatividade contra Atr-I de 15aa de longitude (SPOTs 1 até 9) e Atr-I de 8aa em lugar de 15aa (SPOTs 10 até 15). Estes epítopos foram números do 1 até o 15 (Tabela 4). As regiões identificadas na proteína Atr-I como epítopos identificados experimentalmente com soro Anti-Atr-I se mostram na Figura 16 em azul. Estes SPOTs reativos para esta membrana se encontram publicados em Schenider et al., 2016. Logo a membrana foi lavada e regenerada como indicado na secção de métodos, e exposta logo contra soro Anti-BaP1, identificando assim outras regiões dentro da sequência da Atr-I (Tabela 5) indicadas em cor laranja na Figura 16. Esta reatividade é chamada de cruzada e é causada pela semelhança destas proteínas (Cohn 1953). Por ultimo a membrana foi lavada e exposta contra o soro Anti-Leuc-a identificando regiões diferentes na Atr-I representadas em amarelo (Figura 16).

Figura 16. Reatividade na membrana ligada mostrando a reatividade contra a sequência primaria da proteína Atr-I exposta a anticorpos IgG purificados Anti-Atr-I produzidos em coelhos (línea azul). O soro Anti-BaP1 e Anti-Leuc-a foram produzidos em camundongos estão representados por uma línea laranja e o soro Anti-Leuc-a por amarelo.

Tabela 4. Epítopos identificados por SPOT síntese usando o soro Anti-Atroxlysin-I

Na primeira coluna se indica o numero do epítopo. Na segunda se mostra a sequência de aminoácidos e na terceira a proteína na qual pertence o epítopo.

Utilizando esta metodologia foi possível avaliar a proteína BaP1 de Bothrops asper frente a os soros anti-Bap-I, Atr-I e Leuc-a (Figura 17.). Esta mostro reatividade contra os soros anti-Leuc-a e anti-BaP1, indicando reatividade cruzada. Esta reatividade pode se dever a vários fatores como: similaridade na composição dos epítopos, resíduos críticos iguais, semelhança com outros antígenos expostos naturalmente no organismo onde o soro foi produzido entre outros. As sequências dos epítopos identificados com este soro foram numerados como epítopos #16 até #24 dos quais, o numero 16 pertencente a proteína Atr-I sintetizada com peptídeos de 8aa no lugar de 15aa. Os números 17 e 18 pertencem na proteína Leuc-a. Os números 19 até 24 pertencem na proteína BaP1, a qual é a proteína alvo do soro anti -veneno de B. asper. Entretanto os epítopos 16 ao 18 representam a reatividade cruzada do soro. Estes epítopos se encontram listados na tabela 5.

Figura 17. Reatividade na membrana dos soros anti-Atr-I, anti-BaP1 e anti-Leuc-a contra a Proteina BaP1. As regiões relativas a os soros anti-Leuc-a e anti-BaP1 estão representados por líneas amarela e laranja respectivamente. O soro anti-

Tabela 5. Epítopos identificados por SPOT síntese usando o soro anti-BaP1

Na primeira coluna se indica o numero do epítopo. Na segunda se mostra a sequência de aminoácidos e na terceira a proteína na qual pertence o epítopo.

A reatividade estes três soros anti- proteínas Atr-I, BaP1 e Leuc-a contra a proteína Leuc-a se mostra na Figura 18. O maior numero de epítopos foi identificado com o soro anti-Leuc-a. Este soro que mostro ser o mais reativo identificando 13 peptídeos de Atr-I, números 26 até 38. Na Leuc-a se identifico 18 peptídeos, números 39 ao 56. Entretanto na proteína BaP1 foram 5 peptídeos identificados como epítopos, números 57 até 61. Todas as sequências identificadas na membrana (Fig.18) se mostram na tabela 6.

Todas estas regiões identificadas foram consideradas como o controle experimental positivo ao momento de ser comparados com os resultados computacionais. É importante indicar que estes resultados experimentais são parte de outros projetos do laboratório e principalmente da pesquisa realizada sobre metaloproteases realizada pelo Francisco Santos (Schneider et al., 2012, 2015).

Figura 18. Reatividade na membrana dos soros anti-Atr-I, anti-BaP1 e anti-Leuc-a contra a Proteina Leuc-a. As regiões relativas a os soros anti-Leuc-a e anti-BaP1 estão representados por líneas amarela e laranja respectivamente. O soro anti-

Atr-I não mostro reatividade contra peptídeos referentes a esta proteína.

A reatividade entre os soros anti-Leuc-a e anti-BaP1 poderia estar atribuída na similar identidade que eles apresentam (78.22%) mas não explica por que são reativos com a proteína Atr-I sendo que a similaridade é de 50% com Leuc-a e 55.45% com BaP1. Este resultado poderia estar relacionado a tipo de animal imunizado, como mostrado anteriormente, anticorpos produzidos em animais diferentes mostram diferencias nos epítopos que reconhecem (Gerdts et al., 2007). Assim, o soro anti-Atr-I tinha sido produzido em coelho enquanto os soros anti-Leuc-a e anti-BaP1 foram produzidos em camundongos. Outra variável que pode afetar o sucesso durante a produção de anticorpos é a via de inoculação como demonstrado na literatura (Gerdts et al., 2001 Mutwiri et al., 2002).

A tabela 7 mostra estas identidades entre as proteínas Atr-I, Leuc-a e BaP1, após de um alinhamento entre elas mesmas usando o software ClustalW.

Tabela 6. Epítopos identificados em membrana usando soro anti-Leuc-a

Na primeira coluna se indica o numero do epítopo. Na segunda se mostra a sequência de aminoácidos e na terceira a proteína na qual pertence o epítopo.

Tabela 7. Identidade entre as proteinase Atr-I, BaP1 e Leuc-a.

Estes resultados são interessantes por tratar-se da identificação de epítopos novos em um grupo bem conhecido de enzimas de venenos (Fox et al., 2008). Mostramos aqui que alem destas proteínas ser similares com um mínimo de 50% e um Maximo de 78%, possuem epítopos diferentes em 1-2 aminoácidos mas em regiões similares, ressaltando a importância da conservação de estruturas e possivelmente indicando resíduos críticos em comum. (Takeda et al., 2011).