Marcação de C albicans

A marcação das leveduras e do biofilme de Candida albicans ATCC 90028 foi utilizada como uma forma adicional de observação da atividade da lectina após a conjugação aos pontos de CdTe -AMP e CdTe–MAS, devido as seguintes características apresentadas por este microrganismo:

- Os fungos são microrganismos que apresentarem parede celular composta por carboidratos (80-90%; β-glucanas, quitina e glico[manno]proteínas), proteínas (6- 25%) e lipídios (1-7%), favorecendo a ligação da Con A nesta estrutura celular fúngica (CHAFFIN et al., 1998).

- A C. albicans é um fungo que apresenta diversificação de sua morfologia dependente da temperatura, pH e estádio nutricional, podendo apresentar a forma de levedura, não patogênica a 30ºC; ou a forma filamentosa (hifas, psedohifas e tubo germinativo) e patogênica a 37ºC, que compõem o biofilme (WANSLEY; BANERJEE; McGEADY, 2003).

As suspensões de células a 107 UFC/mL foram incubadas aos pontos quânticos, conjugados ou não a Con A, durante 30 minutos, e em seguida foram microscopicamente analisadas. As imagens por contraste de fase óptico e por

73

fluorescência das células de C. albicans marcadas com CdTe-AMP e CdTe–AMS conjugados a Con A constam na Fig. 4.7.

As leveduras incubadas com os pontos quânticos não conjugados a lectina, não apresentaram fluorescência; demonstrando que a marcação observada nas células incubadas com os CdTe-AMP/Con A e CdTe-AMS/Con A foi mediada pela ligação específica entre Con A e as glico(mano)proteínas da perede celular da levedura. Estes resultados permitem concluir que a conjugação, entre os pontos quânticos e a Con A ocorreu de forma satisfatória: não induziu mudanças significativas na estrutura da proteína nem alterou sua atividade biológica.

Fig. 4.7 Imagens de contraste de fase óptico (A e C) e de microscopia confocal (B e D) das leveduras de C. albicans marcadas por (A e B) CdTe–AMP/Con A e (C e D) CdTe–AMS/Con A. λexc = 473 nm.

O biofilme de C. albicans foi desenvolvido após 48 h de crescimento a 37 ºC, sob uma lamínula submersa numa suspensão a 107 UFC/mL, em tampão fosfato salino 0,01M. Cada lamínula foi incubada com os pontos quânticos, conjugados ou não a Con A, durante 1½ h, e em seguida foram microscopicamente analisadas. A incubação dos biofilmes com os pontos quânticos conjugados ou não conjugados a lectina apresentou comportamento semelhante ao observado para as leveduras, onde apenas os biofilmes incubados aos pontos quânticos conjugados a Con A apresentaram fluorescência. As imagens dos biofilmes de C. albicans marcados por CdTe-AMP e CdTe–AMS conjugados a Con A são demonstrados na Fig. 4.8.

Fig. 4.8 Imagens de contraste de fase óptico (A e C) e de microscopia de flourescência (B e D) do biofilme de C. albicans marcado por (A e B) CdTe–AMP/Con A e (C e D) CdTe–AMS/Con A. λexc = 480/40 nm e λexc = 560/40 nm, respectivamente.

As imagens demonstram que a marcação abrangeu a todas as formas de apresentação de C. albicans observáveis no biofilme: leveduras em brotamento ou

75

não, pseudo-hifas e hifas; apesar de apresentarem pequena modificação no percentual dos constituintes da parede celular (CHAFFIN et al., 1998).

4.4 Marcação Histoquímica das Lesões e Tecido de Mama Normal

O emprego de PQs em protocolos de marcação histoquímica tem permitido a marcação de moléculas biológicas como: o receptor-2 do fator de crescimento epidérmico humano, em câncer de mama invasivo (CHEN et al., 2009), a detecção de antígenos da camada de pigmentos da retina humana (PETTY et al., 2010), a visualização e localização intracelular do homônio do crescimento e prolactina, na glândula pituitária de ratos (MATSUNO et al., 2005) e a observação do perfil de glicosilação na mama normal e com fibroadenoma (SANTOS et al., 2006).

Nesse estudo, PQs de CdTe-AMP e CdTe–AMS, conjugados a Con A e Antigal-3, foram aplicados como marcadores biológicos fluorescentes em protocolos de marcação histoquímica de secções da mama normal (MN), com fibroadenoma (FIB) e com carcinoma ductal invasivo (CDI) devido as seguintes motivações:

- A Con A é uma lectina de reconhecimento específico aos resíduos α-D- manopiranosil e α-D-glicopiranosil (DEREWENDA et al., 1989), que permite a observação de diferentes perfis de glicosilação celular quando aplicada no estudo do câncer (LIMA et al., 201; MITANI; MURAKAMI; TANAKA, 1984).

- A galectina-3 é uma lectina animal que apresenta variação do perfil de expressão em processos fisiológicos (por exemplo, inflamação) e tem sido correlacionada à progressão tumoral e metástase (BALAN; NANGIA-MAKKER; RAZ, 2010; RABINOVICH; RUBINSTEIN; TOSCANO, 2002); podendo ser detectada pela ligação específica ao anticorpo monoclonal antigalectina-3 (Antigal-3).

- As diferenças apresentadas entre o tecido de MN, FIB e CDI, como descrito anteriormente; onde o tecido de MN é caracterizado pela presença de células mioepiteliais em torno das glândulas, separadas por tecido conjuntivo denso (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008); o FIB apresenta proliferação acentuada de tecido glandular (epitelial) e estromal (conjuntivo e adiposo), podendo resultar na compressão dos ductos (KUIJPER et al., 2001); e no CDI as glândulas apresentam forma e tamanho variado, arranjo desordenado e ausência de camada mioepitelial verdadeira, com margens irregulares e presença de infiltração variável de tecido adiposo adjacente, caracterizando o câncer propriamente dito (GUINEBRETIÈRE et al., 2005; SINGH, 2012).

- E, a ocorrência de alterações no perfil molecular apresentado pelos tecidos em estados fisiopatológicos, comparados ao tecido normal, sugerindo que os tecidos com FIB e CDI apresentem alterações no perfil glicosídico celular, permitindo inclusive a discriminação entre lesões benignas e câncer, que é caracterizado por apresentar elevado grau de glicosilação celular (CAZET et al., 2010; SPIRO, 2002).

Os resultados apresentados demonstraram que os PQs de CdTe-AMP/Con A e CdTe-AMP/Antigal-3 não desempenharam marcações satisfatórias sob as condições analisadas. Embora CdTe-AMP/Con A tenha demonstrado excelente marcação das células de C. albicans (leveduras e biofilme), as alterações estruturais na lectina podem ter desfavorecido sua interação ao tecido; assim como a redução da fluorescência do ponto quântico conjugado pode ter ocasionando a visualização não expressiva destas marcações.

Por outro lado, o insucesso da marcação de CdTe-AMP/Antigal-3 pode ter sido ocasionado pela interação do ponto quântico no sítio de reconhecimento antigênico do anticorpo, reduzindo ou impedidndo a ligação específica à galectina-3; tendo em vista que as interações entre antígeno e anticorpo ocorrem através interações moleculares fracas (ex. ligação de hidrogênio, van der Waals, interações hidrofóbicas e forças eletrostáticas) que atuam a curta distância: ~1 Å (GOLDSBY; KINDT; OSBORNE, 2000).

As marcações realizadas por CdTe-AMS/Con A e CdTe-AMS/Antigal-3 demonstraram resultados muito interessantes. A marcação do tecido de MN com CdTe-AMS/Con A não demonstrou marcação expressiva de nenhuma estrutura tecidual, conforme Fig. 4.9.

Fig. 4.9 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência do tecido MN incubado com CdTe–AMS/Con A por 2 h, demonstrando ausência de marcação. Magnif. 200x. λexc = 560/40

77

A interação entre estes pontos quânticos e as lesões de mama demonstrou um perfil de marcação diferencial entre eles. O perfil de marcação glicosídica nos tecidos com FIB, incubados com CdTe–AMS/Con A, demonstrou uma marcação fraca e, por vezes, ausente do tecido conjuntivo e das células epiteliais glandulares e mioepiteliais, sugerindo a reduzida expressão dos glicoconjugados no tecido sob esta condição fisiopatológica, Fig. 4.10.

A

B

C

Fig. 4.10 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência dos tecidos de mama com FIB incubados com CdTe–AMS/Con A por 2 h. (A) Imagem de vasta região de tecido conjuntivo. Magnif. 400x. (B e C) Imagem de tecido glandular demonstrando marcação pronunciada das glândulas mamárias. Magnif. 400x. e 200x. λexc = 560/40 nm.

A incubação dos tecidos com CDI e CdTe-AMS/Con A demonstrou marcação fraca ou ausente do estroma e marcação específica do epitélio glandular, Fig. 4.11.

A

B

C

D

Fig. 4.11 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência dos tecidos com CDI incubados com CdTe-AMS/Con A por 2 h. (A) Região de tecido conjuntivo. Magnif. 200x. (B) Tecido glandular invasivo demonstrando marcação diferenciada das glândulas mamárias. Magnif. 200x. (C e D) Tecido em elevado grau de desestruturação, sem diferenciação entre a região glandular e estromal, demonstrando marcação preferencial do tecido epitelial. Magnif. 630x. λexc = 560/40 nm.

79

Resultados semelhantes foram observados na marcação de tecidos com fibroadenoma comparados aos tecidos de mama normal (SANTOS et al., 2006). E, de forma semelhante a marcação de tecidos com hiperplasia prostática benigna e adenocarcima prostático comparados ao tecido normal, os resultados sugerem um aumento no perfil glicosídico celular com o aumento do grau de desdiferenciação tecidual (LIMA et al., 2010).

A marcação do tecido de MN com CdTe-AMS/Antigal-3 apresentou intensa marcação do estroma e marcação ausente do tecido glandular, Fig. 4.12.

A

B

Fig. 4.12 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência do tecido MN incubado com CdTe–AMS/Antigal-3 por 20 h, (A) demonstrando marcação ausente das glândulas mamárias e (B) marcação pronunciada do estroma. Magnif. 200x. λexc = 560/40 nm.

Não foi observada marcação nas secções teciduais com FIB ou CDI incubadas por 2 h com CdTe-AMS/Antigal-3. Entretanto a incubação por 20 h demonstrou um perfil de marcação diferencial da galectina-3, em ambos os tecidos. Na marcação dos tecidos com FIB foi observada marcação das células glandulares e mioepiteliais, e do tecido conjuntivo, demonstrando a expressão de galectina-3, Fig. 4 13.

A

B

C

Fig. 4.13 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência dos tecidos com FIB incubados com CdTe-AMS/Antigal-3, por 20 h. (A) Região de tecido conjuntivo. (B) Marcação das glândulas e do estroma mamário. (C) Destaque para a marcação das células epiteliais. Magnif. 200x e 630x (destaque). λexc = 560/40 nm.

A incubação das secções teciduais com CDI e CdTe–AMS/Antigal-3, por 20 h, favoreceu a visualização da marcação específica das células epiteliais glandulares, conforme demonstrado em destaque; e marcação ausente do tecido conjuntivo envolvente (estroma), Fig. 4. 14.

81

A

B

C

Fig. 4.14 Imagens de contraste de fase óptico e de fluorescência dos tecidos de mama com CDI incubados com CdTe–AMS/Antigal-3, por 20 h. (A) Imagem de região indiferenciada dos tecidos da mama demonstrando marcação das células epiteliais. Magnif. 200x. (B e C) Imagem demonstrando em destaque a marcação preferencial das células epiteliais difusas no estroma. Magnif. 200x e 630x. λexc = 560/40 nm.

O perfil de marcação observado demonstrou que a lectina endógena galectina- 3 está presente em maior intensidade nas células epiteliais dos tecidos acometidos pelas lesões benigna e maligna da mama.

A expressão considerável de galectina-3 no estroma dos tecidos com FIB é um indicativo da ancoragem das células à matriz extracelular, em contraposição ao observado no tecido com CDI cuja reduzida expressão no tecido conjuntivo das lesões malignas propicia a migração de células cancerígenas a outros tecidos, sugerindo a demonstração do potencial de invasividade deste tipo de lesão (SHEKHAR et al., 2004; SUJATHAN et al., 2011).

Outros estudos indicam que a clivagem da galectina-3 por metaloproteinases da matriz extracelular, MEC, resulta num fragmento no qual o domínio de reconhecimento de carboidratos é conservado, e em outro no qual consta a porção amino-terminal, que é responsável pela promoção da homodimerização desta proteína e a consequente ativação de sua atividade biológica (OCHIENG et al., 1998). Em tecidos com CDI, o percentual de galectina-3 clivada é considerado elevado (NANGIA- MAKKER et al., 2010). A ligação do fragmento clivado de galectina-3 aos sítios ligantes de galectina-3, na MEC, impede a interação entre a proteína não clivada e os respectivos sítios de ligação desta proteína (OLIVEIRA et al., 2010).

Em resumo, estes resultados demonstram que há uma redução no perfil de expressão de galectina-3 no estroma dos tecidos de mama acometidos por lesões benigna e maligna e uma crescente expressão nas células epiteliais, presente em maior grau nas lesões cancerígenas.

CAPÍTULO 5