Marcadores do Cromossomo Y:

V.2.1 Polimorfismos de ponto (SNPs)

V.2.1.1 SNP M242

O alelo derivado M242 T (Seielstad, 2003), SNP ID rs8179021, posição 13527976 do cromossomo Y, caracteriza o haplogrupo Q (Karafet et al. 2008) e foi genotipado através da amplificação por Reação de Cadeia Polimerase (PCR) e enzima de restrição. Iniciadores utilizados: M242F: AACTCTTGATAAACCGTGCTG e M242R:

TCCAATCTCAATTCATGCCTC. Condições da PCR: Tampão de Reação (Invitrogen) 1x, MgCl2 (Invitrogen) 1,5 mM, dNTPs (GE Healthcare) 200 µM, 1 µM de cada iniciador, Taq Polimerase Platinum (Invitrogen) 0,5 u/tubo, 40 ng DNA/tubo (1 µl), água milliQ autoclavada para completar o volume final de 12 µl. Utilizou-se o termociclador PTC-100 (MJ Research. INC.) nas seguintes temperaturas: 1 ciclo 95°C, 5 min, 35 ciclos 94°C, 1 min, 58°C, 1 min, 72°C, 1min, 1 ciclo 72°C, 10 min,1 ciclo de 4°C, 10 min. Tamanho do produto amplificado: 366 pb. As amplificações foram visualizadas em gel de agarose 0,9%, cuba horizontal, Tampão de corrida TAE 0,5%, 5 µl do produto da PCR , 0,5 µl do Tampão de amostra, Padrão 1 KB Plus DNA Ladder (Invitrogen), fonte Bio Rad,100 V, 20 minutos, coloração Brometo de Etídio, visualização UV (Equipamento Ultra – Lum, UV Transiluminator).

Os produtos amplificados pela PCR do marcador M242 foram tratados com a Enzima de Restrição Bsp1286I (Biolabs): Tampão 4 (Biolabs) 0,8 µl, BSA 0,08 µl, enzima 0,5 µl (1U enzima/amostra), produto de PCR 7 µl , 12 hrs banho maria, 37°C.

Os produtos tratados foram visualizados em gel de poliacrilamida 8% ou agarose 2% para visualização dos alelos ancestrais e derivados Os padrões de bandas dos alelos ancestrais e derivados foram visualizados em gel de poliacrilamida 8% não desnaturante, em cuba vertical, tampão de corrida TBE 1x, 5 µl do produto tratado com enzima, 0,5 µl do Tampão de amostra, Padrão 1 KB Plus DNA Ladder (Invitrogen), fonte Bio Rad, 40mA, por no mínimo 3 horas, coloração prata.

.

Sítio de Restrição da enzima Bsp1286I:

5’...GDGCH▼C...3’

3’...C▲HCGDG...5’

V.2.1.2 SNP M3

O alelo derivado M3 ou DYS199 T (Underhill et al. 1996), SNP ID rs3894, posição 17605757 do cromossomo Y, que caracteriza o sub-haplogrupo Q1a3a ou Q-M3 (Karafet et al.2008) foi genotipado através da amplificação por Reação de Cadeia Polimerase (PCR) e enzima de restrição. Iniciadores utilizados: M3F:

TAATCAGTCTCCTCCCAGCA (Underhill et al. 1996) e M3R modificado para reconhecimento o sítio de restrição da enzima MfeI: AGGTACCAGCTCTTCCCAATT (Santos et al. 1999a). O tamanho do produto amplificado é de 202 pb. Condições da PCR: Tampão de Reação (Invitrogen) 1x, MgCl2 (Invitrogen) 1,5 mM, dNTPs (GE Healthcare) 200 µM, 1 µM de cada iniciador, Taq Polimerase Platinum (Invitrogen) 0,5 u/tubo, 40 ng DNA/tubo (1µl), água milliQ autoclavada para completar o volume final de 12 µl. Utilizou-se o termociclador PTC-100 (MJ Research. INC.) nas seguintes temperaturas: 1 ciclo 94°C, 3 min, 30 ciclos 61°C, 20 seg, 72°C, 30 seg,94°C, 20 seg, 1 ciclo 72°C, 7 min,1 ciclo de 4°C, 10 min.

As amplificações foram visualizadas em gel de poliacrilamida 8%, em cuba vertical, tampão TBE 1x, 40 mA, por no mínimo 3 horas, coloração prata. Os produtos de PCR foram tratados com enzima MfeI (Biolabs): tampão 4 (Biolabs) 1,5 µl, água milliQ autoclavada 5,4 µl, MfeI 0,1 µl (0,5U/amostra), 5 µl do produto de PCR, banho maria 12hrs, 37°C. Os padrões de bandas foram visualizados em gel de poliacrilamida 8% não desnaturante, conforme já descrito.

Reconhecimento do sítio de restrição:

5’...C▼AATTG...3’

3’...GTTAA▲C…5’

V.2.2 Microssatélites:

V.2.2.1 Protocolo utilizado na genotipagem dos microssatélites: DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS456, DYS19, DYS458, DYS437, DYS438, DYS448, GATA_H4, DYS391, DYS392, DYS393, DYS439, DYS635.

PCR multiplex: AmpFlSTR® Yfiler™ Kit A&B Applied Biosystems conforme instruções do fabricante.

Genotipagem: GeneScan™ -500 LIZ® Size Standard A&B Applied Biosystems conforme instruções do fabricante.

Equipamento: Sequenciador 3130xl Genetic Analyzer A&B Applied Biosystems.

Capilar 36cm Part No-4315931, Polímero POP 7 A&B Applied Biosystems.

V.2.2.2 Análise populacional de dados dos microssatélites:

A análise dos alelos dos 15 locos de microssatélites foi executada no Programa de Análise GeneMapper® ID Software Versions 3.2, Human Identification analysis A&B Applied Biosystems. Foram analisadas 33 amostras da população Tayacaja (QT), 33 amostras da população de San Martín de Pangoa (SM), 19 amostras da população de Arequipa (QA) e 13 amostras da população de Coyaima (CO), sendo que 5 amostras CO pertencem ao haplogrupo Q1a3a e 8 amostras pertencem ao paragrupo Q*, um total de 98 amostras.

Todas as análises populacionais foram executadas no Programa Arlequin (Excoffier,L. et al. 2006). A análise intrapopulacional foi estimada utilizando cálculos de diversidade haplotípica. Para análise de divergência interpopulacional foi feito um teste exato de diferenciação baseado na freqüência dos haplótipos utilizando 10.000 passos de cadeia de Markov (Raymond e Rousset, 1995). Para cálculos dos componentes da variância genética total foi utilizada a análise de variância molecular (AMOVA). Foram utilizadas as quatro populações: QT (33 amostras), SM (33 amostras), QA (19 amostras) e CO (5 amostras), um total de 90 amostras. As populações foram separadas em dois grupos para a análise do parâmetro RST, na

estrutura hierárquica QT+QA+SM x CO. As três populações foram grupadas por pertencerem geograficamente ao Peru. A população Coyaima é geograficamente distante das três populações e pertence à Colômbia. Também foram feitos o teste exato de diferenciação e análise de Rst par a par entre populações.

V.2.3 Estratégia de busca de novos SNPs

V.2.3.1 Construção de uma rede filogeográfica

Uma rede de haplótipos foi construída pelo método Median Joining usando o software Network 4.5.1.0 (Bandelt et al. 1999) com dados de 6 microssatélites (DYS19, DYS390, DYS391, DYS393, DYS389a e DYS389b) de 117 indígenas americanos com cromossomos Q* (n=14) ou Q-M3 (n=103) oriundos de distintas localidades (Andes Peruanos, Andes Colombianos e Inuits da Groenlândia).

V.2.3.2 Escolha das amostras

Foram selecionados indivíduos com haplótipos divergentes de acordo com sua distribuição na rede filogeográfica (círculos vermelhos na Fig.8), considerando também distintas origens geográficas. Metodologia utilizada: algorítimo Median Joining, software Network (Bandet et al.,1999).

V.2.3.3 Amplificação das amostras

As amostras dos indivíduos selecionados foram amplificadas com os iniciadores descritos em Karafet et al. (2008). Na Tab. 1 são visualizados: a nomenclatura dos marcadores utilizados (SNP), o Haplogrupo a que pertence o marcador, a posição M19 Q1a3a1 20192619 ctggtcataacactggaaatc tgaacctacaaatgtgaaactc 50°C 333 Underhill et al. 1997 M25 Q1a2 20326052 aaagcgagagattcaatccag ttttagcaagttaagtcaccagc 52°C 340 Underhill et al. 2001 M120 Q1a1 20366782 gagcttggactttaggacgg aaactttaaggcacttctggc 50°C 495 Underhill et al. 2001 M143 Q1a2 20165365 catcttaaaatacatttcatagcttt gcttactattaggtctagcatcct 50°C 424 Underhill et al. 2001 M194 Q1a3a2 13523944 gcctggatgaggaagtgag gccttctccatttttgacct 57°C 426 Underhill et al. 2001 M199 Q1a3a3 13540505/4 tgaggtggaatgtatcagtatacc tgatttcaaggatttgttagtctt 55°C 444 Underhill et al. 2001 M323 Q1a6 20327106 gctggcaagacacttctga aatatgttcctgacaccttcc 57°C 352 Shen et al., 2004 M346 Q1a3 2947155 agatgggaaaggcagccaa tctgtccacatgtgtccgtg 57°C 419 Sengupta et al., 2006 M378 Q1b 13536901 tatgcatttgttgagtatatgtc gttctgaatgaaagttcaaacg 55°C 326 Sengupta et al., 2006 MEH2 Q1a 4985637 attcataatatttgattcagaacag taccatgaaaattcataatccaca 55°C 938 YCC, 2002

N14 Q1a1 13540044 ttagacaacttactactttg taaacattacatgagaaatt 55°C 445 Deng et al. 2004 P36.2 Q1 13006449 tgaaggacagtaagtacaca taagtccattgatctacaga 50°C 637 YCC, 2002 P48 Q1a4 13006660 tgaaggacagtaagtacaca taagtccattgatctacaga 55°C 637 Hammer et al. 2003 P89 Q1a5 13359859 acattacaggaccttgat tgcctaacaatactccc 55°C 857 Wilder et al. 2004 P106 Q1a3a3 13932316 ttattccacccagcactgtta aggcacaaatggtaaggtctt 57°C 1090 Karafet et al.2008 P292 Q1a3a3 13540161 tgaggtggaatgtatcagtatacc tgatttcaaggatttgttagtctt 55°C 444 Karafet et al.2008

Figura 4: Haplogrupo Q

Fonte: Reproduzido de Karafet et al. 2008.

Protocolo das reações de PCR: Tampão de Reação (Invitrogen) 1x/tubo, MgCl2 (Invitrogen) 1,5 mM/tubo, dNTPs (GE Healthcare) 200 µM/tubo, Primer F 1 µM/tubo, Primer R 1 µM/tubo, Taq Polimerase Platinum (Invitrogen) 0,5 u/tubo, Betaine 3,5µl/tubo, 40 ng DNA/tubo (1µl), água milliq autoclavada para completar o volume final de 20µl . Utilizou-se o termociclador PTC-100 (MJ Reserarch. INC.) nas seguintes temperaturas: 1 ciclo 95°C, 5 min, 35 ciclos nas temperaturas padronizadas para cada marcador (Fig. 1), 1 min, 58°C, 1 min, 72°C, 1min, 1 ciclo 72°C, 10 min,1 ciclo de 4°C, 10 min.As amplificações foram visualizadas em gel de agarose 0,9% conforme descrito anteriormente.

V.2.3.4 Sequenciamento das amostras amplificadas

Foram sequenciados 14 locos de cópia única do cromossomo Y nos indivíduos selecionados (totalizando ~6.000 nucleotídeos analisados). Reação de Sequenciamento: Kit DyEnamic™ ET dye terminator (GE Healthcare), volume final de reação de 10µl conforme instrução do fabricante. Matrix 93-79672 MegaBace

Haplogrupo Q (Karafet et al. 2008)

Long Read Matrix. Equipamento: Sequenciador MegaBACE 1000.

O marcador M194 teve reações de PCRs repetidas para a amostra de interesse de confirmação e seqüenciadas mais 60 amostras Q (dados não publicados) no Sequenciador 3130xl Genetic Analyzer A&B Applied Biosystems.

Capilar 36cm Part No-4315931, Polímero POP 7 A&B Applied Biosystems.

V.2.3.5 Alinhamento das sequências

O alinhamento das seqüências, comparação com sequências de referência e conferência dos polimorfismos foram feitas através dos programas Phred, Phrap, Consed e MEGA4 Clusta l (Tamura et al. 2007). Foi analisado um total de 112 sequências.

V.2.3.6 PCR TEMPO REAL

Foram testadas 52 amostras de ameríndios da região dos Andes Peruanos (dados não publicados), em PCR Tempo Real , dentre as quais 20 eram novas amostras Q-M3 para o novo polimorfismo encontrado.

Reação de genotipagem: 0,25 µl da solução de genotipagem TaqMan Genotyping Assay Mix (20x), contendo a sonda encomendada pelo grupo de trabalho à Applied Biosystems; 2,50 µl da solução de TaqMan Genotyping Assay Mix (20x); 2,25 µl de DNA (1 a 4 ng). Equipamento: 7900HT Fast Real time PCR System, Applied Biosystems.