Antes do início da utilização de técnicas moleculares para a detecção de variabilidade genética com base na seqüência de DNA, os marcadores morfológicos eram muito utilizados para estudos genéticos tais como ligação gênica e, também, para a construção de mapas genéticos. No entanto, a probabilidade de associações significativas entre marcadores morfológicos e caracteres agronomicamente importantes era reduzida, devido ao pequeno número desses marcadores em uma mesma linhagem, tornando seu uso limitado (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Guimarães & Moreira, 1999).
Atualmente, diversas técnicas de biologia molecular estão disponíveis para a detecção de polimorfismo genético em várias espécies de plantas, o que não ocorria com os marcadores morfológicos, que se restringiam a poucas espécies de plantas utilizadas como sistemas modelo para estudos genéticos, tais como milho, tomate e ervilha, nas quais a disponibilidade de informações genéticas eram maiores.
São muitas as aplicações dos marcadores moleculares em plantas, sendo principalmente utilizados em análises de diversidade genética, na caracterização de germoplasma e no mapeamento de genes e QTLs de interesse (Lande & Thompson, 1990; Thompson & Nelson, 1998; Reyna & Sneller, 2001; Yuan et al., 2002; Cornelious & Sneller, 2002; Webb et al., 1995; Chang et al., 1996; Chang et al., 1997; Concibido et al., 1997; Meksem et al., 1999).
Há vários tipos de marcadores moleculares disponíveis para estudos genéticos, sendo que os mais utilizados são as Isoenzimas, o RFLP, o RAPD, o AFLP e os microssatélites (SSR)
2.3.1 Isoenzimas
Isoenzimas são definidas como um grupo de múltiplas formas moleculares de uma mesma enzima que ocorre em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas (Moss, 1982). A disseminação da utilização
de marcadores genéticos em estudos dde genética e melhoramento iniciou-se com o desenvolvimento dos marcadores isoenzimáticos.
Os marcadores isoenzimáticos, de expressão codominante, são utilizados principalmente em estudos de variabilidade genética de populações naturais, fluxo gênico entre populações, filogenias, identificação de variedades, introgressão gênica e avaliação de germoplasma (Ferreira & Grattaplaglia, 1998). No entanto, além das vantagens de utilização desses marcadores para os estudos genéticos antes citados, há também desvantagens, sendo uma delas a limitação de uso em estudos para construção de mapas genéticos saturados, o que dificulta a identificação de associação significativa entre os marcadores e caracteres de interesse agronômico, principalmente os que são poligênicos, ou seja, de herança quantitativa.
Em soja, atualmente, uma das importantes aplicações das isoenzimas tem sido verificada em estudos relacionados à lipoxigenase (Fischer et al., 1999; Skrzypczak- Jankun et al., 1997; Kariapper et al., 2001).
2.3.2 Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)
Os marcadores RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), identificam polimorfismos no comprimento de fragmentos, obtidos por corte da fita dupla de DNA utilizando enzimas de restrição e observados por hibridização dos fragmentos com seqüências marcadas radioativamente ou por compostos que desencadeiam luminescência (Ferreira & Grattapaglia, 1998). O polimorfismo é gerado pela ausência ou presença dos sítios de clivagem das enzimas de restrição, os quais são constituídos de quatro a oito pares de base. As diferenças também podem resultar de inserções, deleções, translocações e/ou inversões, que alteram a distância entre os sítios de restrição.
Dentre as vantagens de utilização desses marcadores, está o potencial de cobertura de todo o genoma, aumentando a probabilidade de associações destes marcadores a genes que controlam um caráter de interesse. Além disso, são marcadores
codominantes e atuam em regiões transcritas e não transcritas do DNA. Porém, a técnica utilizada é muito trabalhosa e requer uma biblioteca de sondas para hibridização. Outra dificuldade existente é a utilização de material radioativo, que exige estrutura adequada e pessoal apto a trabalhar com radioatividade.
Esses marcadores são muito utilizados no melhoramento, como também em estudos de sintenia entre diferentes espécies, visando estudar a conservação na ordem relativa de locos no cromossomo.
2.3.3 Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD)
Em 1990, com o desenvolvimento da técnica de RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990; Welsh & McClelland, 1990), ocorreu um
grande avanço na área de marcadores moleculares baseados em PCR, pois surgiu a idéia de se utilizar primers mais curtos e de seqüência arbitrária nas reações de amplificação, o que torna a seqüência alvo desconhecida.
O RAPD é uma variação da técnica de PCR, diferindo desta por utilizar apenas um primer. Para que haja amplificação de um fragmento, duas seqüências de DNA complementares ao primer arbitrário devem estar adjacentes e em orientação oposta. Cada um desses primers arbitrários dirige a síntese de vários segmentos diferentes de DNA, de vários pontos do genoma, resultando em várias bandas no gel. Os marcadores RAPD se comportam como marcadores genéticos dominantes, pois ao se observar uma banda no gel, não é possível distinguir se o segmento amplificado é originário de uma ou de duas cópias da seqüência amplificada.
Uma das fontes do polimorfismo gerado quando se utiliza essa técnica pode advir de mutações de ponto nos sítios de reconhecimento dos primers. Além disso, as deleções desses sítios de iniciação faz com que a DNA polimerase seja incapaz de amplificar segmentos longos de DNA, levando a uma interpretação binária dos resultados, ou seja, o segmento amplificado está presente ou ausente no gel.
Os marcadores RAPD são utilizados para a obtenção de impressãoes digitais (fingerprints) genômicas de indivíduos, cultivares e populações; análise da estrutura e diversidade genética (Li & Nelson, 2001; Thompson et al., 1998; Thompson & Nelson, 1998); estudos de filogenia; e, construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica e localização de genes de interesse econômico (Ferreira et al., 2000, MacGregor et al., 2002). No entanto, esses marcadores possuem algumas limitações, sendo uma delas o baixo conteúdo de informação genética por loco, inviabilizando estudos genéticos quando há necessidade de se identificar os genótipos heterozigóticos.
2.3.4 Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)
A técnica do AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) foi desenvolvida por Zabeau & Vos (1993) e vem sendo muito utilizada para a obtenção de um grande número de marcadores moleculares distribuídos em genomas de eucariotos e procariotos. Para a análise de AFLP são realizadas quatro etapas: clivagem do DNA genômico total com duas enzimas de restrição, sendo uma de corte raro e uma de corte freqüente, uma de cada vez; ligação de adaptadores específicos aos terminais dos fragmentos genômicos gerados pela clivagem; amplificação seletiva de uma fração dos fragmentos via PCR utilizando primers específicos para reconhecer seqüências nos adaptadores; e, separação da subpopulação de fragmentos em gel de alta resolução (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A análise de AFLP vem sendo utilizada de forma crescente para finalidades de impressão digital genômica (fingerprinting), mapeamento genético localizado (Bulk Segregant Analysis – BSA) e construção de mapas genéticos, principalmente em espécies de plantas cultivadas que apresentam uma baixa taxa de polimorfismo de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Os marcadores AFLP, da mesma forma que os marcadores RAPD, se comportam como marcadores genéticos dominantes, ou seja, não é possível identificar diretamente os genótipos heterozigóticos.
2.3.5 Marcadores baseados na amplificação de microssatélites (SSR)
No genoma dos organismos eucariontes existem muitas seqüências repetitivas de DNA que se localizam em regiões de micro e mini-satélites. Nas drosófilas, por exemplo, 30% do genoma é formado por este tipo de seqüência; no arroz, 50%; e no tabaco chega a 70% (Lewin, 2001). Uma dessas classes consiste na repetição em tandem de dois a cinco nucleotídeos, denominados microssatélites, ou Simple SequenceRepeats (SSR). A seqüência de DNA que flanqueia essas regiões contendo repetições curtas são conservadas dentro de uma espécie, permitindo a seleção de primers de PCR que podem ser utilizados para amplificar os SSRs. Após amplificação dessas regiões específicas, o polimorfismo no tamanho dos fragmentos obtidos é devido ao número diferente de repetições das seqüências simples. Os microssatélites são marcadores codominantes e multialélicos, fornecendo um elevado nível de informação genética por loco.
Os marcadores microssatélites tornaram-se rapidamente os mais utilizados pelos geneticistas de humanos, para o desenvolvimento de mapas de ligação e para a identificação de indivíduos. Em plantas, os microssatélites são muito freqüentes e distribuídos ao acaso ao longo do genoma, também sendo amplamente utilizados nos estudos de diversidade genética, caracterização de germoplasma, construção de mapas genéticos e mapeamentos de genes e QTLs.
Em soja, os marcadores microssatélites têm sido muito utilizados para o mapeamento de genes específicos que determinam características agronomicamente importantes e, também, para a identificação de QTLs de importância econômica envolvidos na produtividade de grãos e na resistência genética a pragas e doenças, que são características de herança complexa (Webb et al., 1995; Chang et al., 1996; Mansur et al., 1996; Concibido et al., 1997; Njiti et al., 1997; Meksem et al., 1999; Mian et al., 1999; Arahana et al., 2001; Bachman et al., 2001; Schuster et al., 2001; Yang et al., 2001; Yuan et al., 2002).