Foram utilizadas 20 ratas albinas (Rattus norvegicus albinus) com 90 dias de idade, virgens, pesando 200g ± 30g, da linhagem Wistar, procedentes do Biotério do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, da Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE. As fêmeas foram confinadas em gaiolas e mantidas com alimentação e água “add libitum”, a uma temperatura de 22°C e iluminação artificial que estabeleceram um fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas escuro. O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética institucional, de nº. 23082.017195/2010.
As fêmeas dos grupos experimentais foram acasaladas e após a confirmação, foram separadas, ao acaso, em quatro grupos, cada um contendo cinco animais, a saber: Grupo I – ratas prenhes sem tratamento (Controle); Grupo II – ratas prenhes tratadas com dexametasona 10 dias após a confirmação do acasalamento, até o final da prenhez;
37 Grupo lll - ratas prenhes tratadas com melatonina 10 dias após a confirmação do acasalamento, até o final da prenhez; Grupo lV: ratas prenhes tratadas com dexametasona e melatonina 10 dias após a confirmação do acasalamento, até o final da prenhez.
Para o experimento foi utilizado a formulação comercial Decadron® (fosfato dissódico de dexametasona) administrado por via intraperitoneal nas ratas dos grupos II e IV, na dose de 0,8mg/kg/animal (Vilaça Júnior et al., 2008), preferencialmente em horário das 17:00 às 18:00 horas, com redução progressiva da dose em 10% até obtenção da dose zero no último dia de administração.
A administração de melatonina foi realizada nas ratas dos grupos III e lV de acordo com o protocolo estabelecido por Kim et al. (1998). A melatonina foi dissolvida diariamente em solução de etanol-salina (0,1 mL de etanol e 0,3 mL de solução salina) e administrada imediatamente por via intraperitoneal entre as 17:00 e 18:00 horas (Subramanian et al., 2007). A dose de melatonina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) administrada foi de 0,5 mg/Kg. Como placebo foi administrado às ratas do grupo I a mesma concentração de solução salina e etanol (3:1) em pH fisiológico.
Foram realizadas coletas nas fêmeas no 7o, 14o e 21o dia de prenhez. A coleta foi realizada através da punção da veia caudal lateral com uso de cateter (24G) mediante contenção mecânica (Fluttert; Dalm; Oitzl, 2000). Para subsequente obtenção do plasma parte das amostras foram submetidas à centrifugação a uma temperatura de 4°C com a velocidade de 3000rpm durante 10 minutos. O plasma obtido foi acondicionado à temperatura de -20ºC. Após a última coleta, as fêmeas foram anestesiadas com xilazina (20 mg/kg) e quetamina (10 mg/kg), por via intraperitoneal. Foi realizada a abertura da cavidade abdominal para remoção total do fígado, rins e adrenais. Após a coleta dos órgãos foi realizada a eutanásia utilizando-se câmara de CO2 seguindo as recomendações da resolução do CFMV nº 714, de 20 de julho de 2002.
Para a contagem total de eritrócitos, alíquotas de sangue total foram diluídas em solução de Hayem na proporção de 1:40 e contadas em câmara de Neubauer. Na seqüência, os resultados foram submetidos à fórmula: Hm x 5 x 400 x 10, onde: Hm é o número total de hemácias contadas (em 1/5 mm2), 5 é o fator de conservação para 1 mm2, 400 é o fator do conservação da diluição e 10 é o fator de conservação para 1 mm3 (profundidade da lâmina). Para a contagem total de leucócitos as alíquotas foram diluídas em solução de Turk na proporção de 1:20 e contadas na câmara de Neubauer. O
38 resultado foi submetido à seguinte fórmula: leucócitos/mm3 de sangue= Lc x 20 x 10/ 4, onde Lc é o número total de leucócitos contados em 4 mm2, 4 é o fator de conservação para 1 mm3, 20 de diluição utilizada e 10 para 1 mm3 (profundidade da lâmina). A contagem diferencial dos leucócitos foi realizada utilizando-se a técnica do esfregaço sanguíneo corado pelo Kit Panótico Rápido LB – Laborclin Ltda, Após a secagem, os esfregaços foram analisados ao microscópio óptico com objetiva de imersão (100x), sendo contadas 100 células através de movimentos de ziguezague sobre a lâmina em um único sentido. Os diferentes elementos foram contabilizados através da utilização de um contador eletrônico.
Para obtenção do volume do hematócrito um tubo de micro-hematócrito foi preenchido com sangue até aproximadamente ¾ de sua capacidade e submetido à centrifugação (centrifuga Sigma modelo 1-15) a 6000 rpm por 5 minutos. A altura da coluna de hemácias e leucócitos foi medida como percentagem da coluna de sangue total em cartão especial para leitura de hematócrito. Após constatado variação no hemograma nas ratas do grupo II, realizou-se novas coletas aos 14, 16, 18 e 20 dias nos grupos I e II para averiguar em que momento esses variações tinham início e como elas se comportavam ao longo desse intervalo.
Para análise de carboidratos totais amostras de plasma foram submetidas à desproteinização, realizada com ácido tricloroacético a 5% (TCA 5%) numa proporção de 1:10, diluídas e centrifugadas a velocidade de 3000rpm por 3 minutos. O sobrenadante foi mantido à temperatura de 4°C. Para a preparação da curva de calibração foi utilizada uma solução estoque de glicose em água destilada na concentração 1g/L. Foram realizadas sucessivas diluições e as concentrações utilizadas foram: 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 e 0.01562g/L. Como branco utilizou-se água destilada. Para a dosagem de carboidratos totais do sangue foi utilizado o protocolo adaptado de Laurentini; Edwards (2003). As amostras e padrões foram submetidos à leitura do comprimento de onda de 620nm em leitora de microplaca (Anthos 2010 Microplate Absorbance Reader, Biochrom Ltd, Cambridge, UK).
Os níveis do hormônio progesterona foram dosados utilizando-se o método enzyme Linked Immunosorbet Assay (ELISA), através de KIT's comerciais.
O fígado, rins e adrenais coletados foram fixados em Formol 10% tamponado por 24 horas, desidratados em concentrações crescentes de álcool, diafanizados em xilol e impregnados para inclusão em parafina. Em seguida, os cortes foram submetidos à
39 técnica de coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Para histoquímica do fígado e adrenais empregou-se os corantes Ácido periódico de Schiff (PAS) e Impregnação argêntica.
O estudo morfométrico do fígado foi realizado segundo a metodologia descrita por Engelman et al. (2001), utilizando uma quadrícula com 100 pontos-teste, colocada sobre os cortes das preparações histológicas coradas pelo HE. A contagem foi feita em cinco lâminas por grupo. Para morfometria dos rins foram utilizadas cinco lâminas de cada grupo e analisados 10 glomérulos em cada lâmina. As medidas foram restritas aos glomérulos que demonstraram, num único corte, os pólos vascular e urinário. A captura da imagem foi efetuada por meio de câmera de Vídeo Sony®, acoplada ao microscópio Olympus® Bx50. A morfometria foi realizada através de aplicativo Morfometria de Linhas, calibrado em micrômetros, associado ao programa Optimas® 6.2 para Windows. Para a obtenção da área glomerular o cursor foi posicionado na área central deste, estabelecendo-se, a partir daí, uma linha circular externa, coincidente com os limites do tufo glomerular. Foi utilizada a mesma metodologia para a mensuração da cápsula de Bowman (Akaoka; White; Raafat, 1994). Lâminas contendo corte das adrenais foram avaliadas quanto à área da zona da cortical e medular, utilizando-se a mesma metodologia para a morfometria dos glomérulos renais citada anteriormente.
Para morfometria das hemácias no período de 14 e 21 dias de gestação dos grupos experimetais, foram utilizadas 15 lâminas/grupo/período, sendo mensuradas 100 células por lâmina por meio de régua milimetrada.
Análise Estatística
Os dados obtidos dos parâmetros hematológicos, carboidratos totais, níveis hormonais, bem como os dados morfométricos das hemácias, adrenais, fígado e rins foram submetidos ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, onde as médias obtidas foram comparadas pelo teste de Wilcoxon Mann-Whitney (p< 0,05). As amostras para as análises hematológicas, carboidratos totais e níveis hormonais foram tomadas em triplicatas.
3. Resultados
40 Nas tabelas 1, 2 e 3 estão sumarizadas as médias e desvio-padrão do hematócrito, número total de hemácias, número total de leucócitos e contagem diferencial dos leucócitos, das matrizes, no 7o, 14o e 21o dias de gestação, respectivamente. No 7o dia de gestação não houve alteração significativa nos parâmetros analisados nos grupos experimentais (Tabela 1). No entanto, aos 14 dias de gestação houve aumento significativo do volume de hematócrito e redução do número total de hemácias e leucócitos. A contagem diferencial dos leucócitos revelou uma significativa neutrofilia, linfopenia e eosinopenia nas matrizes tratadas com dexametasona, em relação aos outros grupos experimentais (Tabela 2). No terço final da gestação as fêmeas do grupo tratado com dexametasona apresentaram redução dos valores de hematócrito, redução do número total de hemácias e leucócitos, além de neutrofilia, linfopenia e eosinopenia (Tabela 3). Após ter constatado variação significativa no hematócrito e na contagem total de hemácias e leucócitos nas ratas tratadas apenas com dexametasona nos intervalos de 14 e 21 dias, foram feitas novas análises aos 14, 16, 18 e 20 dias de prenhez nas ratas dos grupos I e II. De acordo com análise estatística verificou-se que no grupo II, em relação ao grupo controle, o valor do hematócrito apresentou-se elevado aos 14 dias, normalizando-se aos 16 e 18 dias, porém reduzindo significativamente no 20o dia. Já as hemácias e leucócitos diminuíram progressivamente ao longo dos intervalos analisados, bem como os linfócitos e eosinófilos, porém os neutrófilos aumentaram progressivamente (Tabelas 4, 5, 6 e 7). Como intuito de verificar uma possível anisocitose realizou-se medição do diâmetro das hemácias de todos os grupos experimentais. As fêmeas do grupo II apresentaram hemácias com diâmetro significativamente menor em relação aos outros grupos (Tabela 8).
3.2. Níveis plasmáticos de carboidratos totais e progesterona
Os níveis séricos de glicose nas matrizes no 7o e 14o dia de prenhez não apresentaram variação significativa, porém houve diminuição no grupo II em relação aos outros grupos experimentais no 21o de gestação (Tabela 9). A dosagem dos níveis séricos de progesterona revelou uma diminuição significativa desse hormônio aos 14 e 21 dias de prenhez nas ratas do grupo tratado com dexametasona (Tabela 10).
41 De acordo com a análise estatística não houve influência dos tratamentos sobre os parâmetros morfométricos no fígado, rins e adrenais (Tabela 11). Também não foram evidenciadas alterações histoquímicas nesses órgãos (Fig. 1).
4. Discussão
Os corticóides atuam sobre o efeito da circulação de leucócitos; interferindo no mecanismo da imunidade linfocitária; modulando os mediadores da inflamação e modificando as proteínas, carboidratos e o metabolismo de gorduras. Seus efeitos sobre os componentes do sistema imune são: em relação aos neutrófilos = neutrofilia, depressão da quimiotaxia, depressão da marginação, depressão da fagocitose, depressão da reação de citotoxidade mediada por células dependentes de anticorpo, depressão da atividade bactericida; linfócitos = depressão da proliferação, depressão da resposta das células T, prejuízos aos mediadores citotóxicos de células T, depressão da produção de IL-2, depressão da produção de linfocinas (Dell’aqua Junior, 2004).
Cupolilo et al. (2007) realizaram experimentos com camundongos fêmeas (Swiss Webster), administrando doses imunossupressoras (5 mg/Kg) e antiinflamatórias (1,5 mg/Kg) de dexametasona via intraperitonial, durante 12 dias. Estes autores observaram redução no número global de leucócitos em ambos os grupos (embora mais acentuada no grupo que recebeu dose imunossupressora). Em nossos estudos, encontramos resultados semelhantes, ocorrendo ao 14º dia de gestação uma redução do número total de leucócitos, além de neutrofilia, linfopenia e eosinopenia nas ratas do grupo II, em relação aos outros grupos experimentais. No terço final (21ºdia) da gestação esses resultados foram mantidos. Isso revela que a administração contínua a partir do décimo dia até o fim da gestação, mesmo com a redução progressiva da dose, possui efeitos imunossupressores. Segundo Giglio; Alippi; Bozzini (1980) a administração de dexametasona induz uma redução característica da síntese de eritropoetina, além de reduzir também a eritropoese. No presente trabalho, ao 14º e 21º dia de gestação observou-se uma redução significativa no número de hemácias nas ratas do grupo II, o que pode está associado à redução da eritropoese. Além disso, verificou-se uma anisocitose do tipo micrócito nas hemácias das fêmeas do grupo II, sugerindo um quadro de anemia, ao passo que nos demais grupos essa característica manteve-se normal, inclusive no grupo IV.
42 Os glicocorticóides também provocam alterações como redução da volemia e aumento da osmolaridade do sangue, pois interferem nos mecanismos de reabsorção de íons (Seckl, 2004). Em nosso trabalho observamos um aumento no hematócrito nas ratas do grupo II ao 14º dia de prenhez que pode sugerir uma disfunção renal (desequilíbrio de sódio, potássio, cloro e outros eletrólitos) em razão da presença da dexametasona levando a um quadro de desidratação que é a causa mais comum de aumento do hematócrito. Já no 21º dia de prenhez, o hematócrito das ratas do grupo II sofreu uma diminuição significativa em relação aos outros grupos experimentais, sugerindo um quadro de anemia.
A melatonina quando associada à dexametasona exerceu um efeito protetor em todos os parâmetros sanguíneos analisados. Segundo Maestroni (1998) a hematopoese é aparentemente influenciada pela ação da melatonina. Além disso, estudos realizados por Lissoni et al., (2003) em pacientes com câncer metástico de pulmão submetidos a uma terapia com quimioterápicos contendo cisplatina, conhecida por induzir a anemia, observaram que os níveis de hemoglobina eram maiores quando os pacientes eram tratados concomitantemente com melatonina. Segundo Srinivasan et al. (2005), a melatonina é benéfica tanto a resposta imune celular quanto a humoral. Ela estimula a produção de citocinas e a produção de células progenitoras de granulócitos, macrófagos, células NK e algumas células T auxiliares (CD4+). Isso explica o efeito imunoprotetor exercido pela melatonina quando administrada nas ratas do grupo IV.
Santos; Rafacho; Bosqueiro (2007) administraram dexametasona (1mg/kg), em diferentes períodos (24h, 72h e 120h), em ratos machos com 90 dias de idade e observaram que os efeitos dos glicocorticóides sobre o metabolismo são particularmente dependentes da dose e do tempo de administração. Estes autores observaram que ocorreu um aumento dos níveis circulantes de insulina plasmática após 24horas de administração da droga juntamente com pequena elevação das concentrações de glicose sanguínea e estes níveis de glicose acentuaram-se nos ratos tratados com dexametasona por 120 horas, estabelecendo-se um quadro de resistência a insulina. Em nosso estudo, porém, os níveis séricos de glicose nas ratas tratadas com dexametasona, ao 14o dia de prenhez, não apresentou variação significativa, e ao 21º dia de prenhez ocorreu uma diminuição desses níveis. Uma vez que foi realizada a redução progressiva diária da dose administrada, pode ter ocorrido uma resposta adaptativa das células β pancreáticas, pois segundo Holness; Sudgen (1997) durante a gestação ocorrem adaptações no metabolismo de carboidratos, culminando com um progressivo estado de resistência a
43 insulina, que impedem a metabolização da glicose materna. Esse quadro promove o aumento de glicose no início da gestação (Ericsson et al., 2007). No entanto, a administração de dexametasona durante o terço final (14º ao 19º dia) estimula a secreção de insulina suprimindo a produção endógena de glicose levando a redução dos seus níveis séricos.
Os níveis séricos de progesterona mostraram-se reduzidos aos 14 e 21 dias de prenhez apenas nas ratas do grupo II. Segundo estudos realizados por Wang; Riley; Behrman (1993), a aplicação de dexametasona até 12 dias aumenta significativamente o nível de progesterona, em até 16 dias os níveis séricos desse hormônio são reduzidos em cerca de 50% e, completamente deprimidos após 19 dias de tratamento. No tratamento dexametasona associado com melatonina (grupo IV), verificou-se um efeito protetor da melatonina mantendo normal os níveis séricos de progesterona. Segundo Tamura et al. (2008), a melatonina, dentre outras funções, estimula a secreção da progesterona, o que reduz a contratilidade uterina e evita a rejeição imunológica do trofoblasto. Estudos realizados por Dair et al. (2008) demonstraram que as taxas de implantação e níveis séricos de progesterona estavam diminuídos em ratos pinealectomizados e que a elevação da melatonina na fase lútea pode induzir a produção de progesterona pelas células luteínicas, o que é necessário para uma gravidez bem sucedida.
A não alteração dos parâmetros morfométricos e histoquímicos no fígado, rins e adrenais, podem está relacionada ao tempo de atividade da dexametasona, pois segundo Pauli et al. (2005) esse glicocorticóide apresenta uma meia vida que varia entre 36 e 54 horas. Outro fato pode está relacionado ao desmame efetuado nas ratas tratadas com dexametasona.
5. Conclusão
A dexametasona na dosagem de 0,8 mg/Kg aplicada a partir do terço médio da gestação produz alterações hematológicas, bioquímicas e hormonais em ratas, porém, não afeta o fígado, rins e adrenais, quanto aos parâmetros morfométricos e histoquímicos. Estes efeitos foram prevenidos pela melatonina.
44 AKAOKA, K.; WHITE, R. H.; RAAFAT, F. Human glomerular growth during childhood: a morphometric study. J. Pathol., v. 173, p. 261-268, 1994.
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47 6. Anexos
Tabela 1. 1Médias de hematócrito, contagem total e diferencial das células sanguíneas das ratas com 7 dias de gestação.
Grupos I II III IV P
Ht (%) 52,73 ± 2,44a 49,66 ± 3,53ª 51,00 ± 1,90ª 48,80 ± 2,32a 0,1012
CTH (106/µL) 4,76 ± 1,24a 4,44 ± 1,49ª 4,71 ± 1,24ª 4,88 ± 1,90a 0,1930 CTL (103/µL) 2,63 ± 0,99a 2,68 ± 0,89ª 2,65 ± 0,53ª 2,70 ± 0,87a 0,2121 Neutrófilos (%) 13,60 ± 2,61a 14,13 ± 1,57ª 12,46 ± 1,80ª 14,63 ± 2,89a 0,4261
Linfócitos (%) 86,06 ± 4,68a 87,33 ± 5,03ª 84,13 ± 3,33a 82,54 ± 2,23a 0,0838
Eosinófilos (%) 1,45 ± 0,26a 1,49 ± 0,29ª 1,20 ± 0,18ª 1,34 ± 0,21a 0,5102
Monócitos (%) 0,53 ± 0,44a 0,40 ± 0,36ª 0,58 ± 0,31ª 0,49 ± 0,32a 0,7581
Basófilos (%) 0,13 ± 0,29a 0,06 ± 0,15ª 0,20 ± 0,13ª 0,18 ± 0,11a 0,7359