MATERIAIS E MÉTODOS EMPREGADOS

3.1.1 Métodos Cromatográficos

3.1.1.1 Cromatografia em Coluna (CC)

Nas cromatografias de adsorção em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60, Art. 7734 da Merck, de partículas com dimensões entre 0,063-0,200mm. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as quantidades das amostras e as quantidades de sílica a serem utilizadas. Como fase móvel foi usado hexano, clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AcOEt) e metanol (CH3OH), puros ou em misturas binárias,

sempre em gradiente crescente de polaridade.

3.1.1.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

Nas Cromatografias em Camada Delgada Analítica (CCDA) e Preparativa (CCDP) foram usadas para sua confecção sílica gel 60 PF254 da Merck (Art. 7749) e placas de vidro

(20x20, 10x20 ou 5x20). As CCD foram preparadas com uma suspensão de sílica, obtida com água destilada e em seguida distribuída sobre a placa de vidro através de um espalhador mecânico (do tipo “quick fit”).

As revelações das substâncias nas CCDA se deram por exposição das placas à lâmpada de irradiação ultravioleta em aparelho Mineralight, modelo UVGL-58 operando em dois comprimentos de onda (254 e 366nm) e/ou pela exposição das placas a vapores de iodo em cuba de vidro fechada.

O grau de pureza das substâncias foi evidenciado por cromatografia em camada delgada analítica (CCDA), determinando-se a pureza quando observada uma única mancha após eluição, em pelo menos três tipos de sistemas de solventes diferentes.

Para eluição das CCD foram usados os solventes hexano, CHCl3, AcOEt e CH3OH,

puros ou em misturas. Nos casos de recristalizações de substâncias foram utilizados solventes grau analítico (PA) da Merck.

3.1.1.3 Cromatografia Líquida sob Vácuo (CLV)

A CLV foi montada em funil de vidro com placa porosa, com dimensões de 4cm de diâmetro e 12cm de altura, o qual foi acoplado a um kitassato. No empacotamento da coluna foi usado como fase estacionária sílica gel 60 da Merck com partículas entre 0,040 – 0,063 (Art. 7734) e misturada a hexano. Após o empacotamento da coluna a amostra foi solubilizada em quantidade de solvente apropriado e misturando a sílica gel 60 até total adsorção da amostra na sílica, que foi então depositada sobre o topo da coluna. Foram usados como fase móvel os solventes orgânicos puros ou nas misturas: CHCl3;

CHCl3:AcOEt (1:1); AcOEt; AcOEt:CH3OH (1:1) e CH3OH. Para forçar a passagem do

solvente na coluna foi aplicada uma pressão negativa (vácuo) no kitassato, sendo então formadas frações de acordo com o solvente aplicado.

3.1.1.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

As análises em CLAE foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL 10 AVP, equipado com uma bomba Shimadzu modelo LC-10AD, detector Shimadzu UV- Vis modelo SPD-10A operando em dois comprimentos de ondas simultaneamente, injetor manual e sistema de integração computadorizada com software CLASS-VP versão 5.02. Foi utilizada coluna analítica C-18 (4,6 x 250mm; 5μm, 100Å) Shimadzu.

3.1.2 Métodos Espectrométricos

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C (RMN de 1H e 13C) uni e bidimensionais foram obtidos em espectrômetros da Varian-Mercury (DRX 500), operando na freqüência de 200MHz para hidrogênio e a 50,3MHz para carbono-13 ou a 500MHz para hidrogênio e 125MHz para carbono-13. As amostras submetidas à análise por RMN foram preparadas dissolvendo-se pequena quantidade das mesmas em solventes deuterados da CIL (Cambridge Isotopes Laboratories) (CDCl3, CD3OD e DMSO-d6). Os

deslocamentos químicos (δ) foram referenciados para RMN de 1_{H pelos picos}

característicos dos hidrogênios pertencentes à fração não deuterada destes solventes em relação ao TMS: clorofórmio (δH= 7,24), CD3OD (δH= 3,33) e DMSO-d6(δH= 3,28) e para

os espectros de RMN de 13C pelos picos dos carbonos da fração não deuterada em relação ao TMS: clorofórmio (δC= 77,0), CD3OD (δC= 49,0) e DMSO-d6 (δC= 39,0).

As multiplicidades das bandas de RMN 1H foram indicadas segundo as convenções: s (sinpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).

3.2 ESTUDO FITOQUÍMICO DE Licania macrophylla Benth (Chrysobanaceae)

3.2.1 Coleta do Material Vegetal

As cascas do caule e folhas das espécies Licania macrophylla Benth (Chrysobalanaceae) e Pradosia huberi (Ducke) Ducke (Sapotaceae) foram coletadas em outubro de 2005 na Reserva Florestal do Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Estado do Amapá (IEPA) localizada no município de Porto Grande - Amapá – Brasil. Exsicatas encontram-se depositadas no Herbário Amapaense HAMAB do IEPA sob os números 011310 e 12519, respectivamente, onde foram usadas na identificação das espécies por comparação com outros espécimes do acervo da coleção botânica do instituto.

3.2.2 Preparação do Material Vegetal

Os materiais vegetais coletados para estudo fitoquímico e farmacológico (cascas do caule e folhas) foram conduzidos ao Laboratório de Fitoquímica do IEPA onde foram submetidos a secagem em estufa de ar circulante à 45ºC e moídos em moinho mecânico até serem reduzidas a partículas pequenas.

3.2.3 Preparação do Extrato Metanólico das Cascas do Caule e Folhas

As cascas do caule (2,3Kg) e folhas (600g) secas e trituradas de Licania

macrophylla foram submetidas a extração por maceração com metanol comercial a

temperatura ambiente, por um período de 10 dias. As soluções extrativas obtidas foram concentradas em evaporador rotativo sob temperatura controlada (45ºC), obtendo-se o Extrato Metanólico das Cascas do Caule (EMC) e o Extrato Metanólico das Folhas (EMF), cujos rendimentos foram: EMC = 15% (345g) e EMF = 7% (42g).

3.2.4 Fracionamento Cromatográfico do EMC de Licania macrophylla

O EMC de Licania macrophylla (20g) foi cromatografado em coluna usando como adsorvente 500g de sílica gel 60 da Merck (Art. 7734) empacotada em suporte de vidro. Após o empacotamento da coluna procedeu-se a eluição com hexano puro até que houvesse uma compactação adequada da sílica. Em seguida aplicou-se a mistura do EMC

com sílica sob o topo da coluna, procedendo-se a eluição com solventes orgânicos puros ou em misturas binárias, em ordem crescente de polaridade (QUADRO 5).

Uma análise em CCDA das 29 frações obtidas, em três sistemas de solvente, revelou perfis cromatográficos diferentes, razão pela qual optou-se pela não reunião das frações. A fração 6 apresentou uma macha mais intensa, sendo então encaminhada para obtenção dos espectros de RMN de 1H e 13C e recebeu o código Lm-2. As frações de maior polaridade (Fr-9 a Fr-17) foram usadas para o desenvolvimento de um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) que permitissem tanto uma análise preliminar do grau de pureza da fração como um método que pudesse ser usado para separação dos constituintes presentes.

Frações Sistema de Solvente

Fr-1 a Fr-2 CHCl3 (100%) Fr-3 a Fr-6 CHCl3 : CH3OH (9 : 1) Fr-7 a Fr-10 CHCl3 : CH3OH (8 : 2) Fr- 11 a Fr-16 CHCl3 : CH3OH (6 : 4) Fr-16 a Fr-22 CHCl3 : CH3OH (1 : 1) Fr-22 a Fr-29 CHCl3 : CH3OH (3 : 7)

QUADRO 5 Dados do fracionamento cromatográfico do EMC de Licania macrophylla. 3.2.5 Desenvolvimento de Método Analítico por CLAE

Para o desenvolvimento do método analítico e de separação foi usado um Cromatógrafo da Shimadzu operando em sistema isocrático dotado de detector de UV-Vis com dois comprimentos de onda. Foi usada coluna analítica C-18 fase reversa (4,6 x 250 mm; 5μm, 100Å) e os solventes orgânicos grau CLAE da Tédia (metanol e acetonitrila), além de água ultra pura (água Mille Q). No desenvolvimento do método foram variadas as proporções dos solventes na mistura e o fluxo de eluição da coluna (QUADRO 6, p.56). Foram obtidos três cromatogramas para cada sistema de solvente e fluxo usado.

Uma análise preliminar dos cromatogramas obtidos permitiu inferir que a fração 9 apresentava um bom grau de pureza, principalmente quando analisada no sistema de solvente com metanol, sendo então indicada para obtenção dos espectros de RMN de 1H e

Sistema de Solventes Fluxo de Eluição H2O : CH3OH (7 : 3) 1 mL/ min H2O : CH3OH (7 : 3) 0,7 mL/ min H2O : CH3OH (8 : 2) 1 mL/ min H2O : CH3OH (8 : 2) 0,7 mL/ min H2O : CH3OH (85 : 15) 1 mL/ min H2O : HCN (7 : 3) 1 mL/ min H2O : HCN (7 : 3) 0,7 mL/ min H2O : HCN (85 : 15) 1 mL/ min H2O : HCN (85 : 15) 0,7 mL/ min

QUADRO 6 Sistemas de solventes x fluxo de coluna usados em CLAE para

eluição das frações 9 a 17 (Fr-9 a Fr-17).