MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. OBTENÇÃO DOS MATERIAIS VEGETAIS

Os materiais vegetais (partes aéreas) Riedeliella graciliflora (falsa-ciganinha);

Crotalaria micans (guizo-de-cascavel); Ipomoea chiliantha (cipó-de-leite), Senna splendida

(amendoim-bravo); Senna aculeata (guelra-de-dourado), Senna pendula (papoula-do-brejo), foram coletados e identificados pelo Dr. Arnildo Pott, da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, na região de Mato Grosso do Sul/ Pantanal, em julho de 2008. Indigofera

truxillensis (planta total) foi coletada pela Profa. Dra. Simone de Pádua Teixeira, da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, na cidade de Botucatu (SP), em outubro de 2009. Os dados das coletas estão apresentados na Tabela 2. O acesso ao patrimônio genético foi permitido pela licença número 010174/2011-7, concedida pelo CGEN/CNPq.

Tabela 2. Dados das coletas das plantas pertencentes a este estudo.

Espécie Herbário Coletor Local Coordenada

Riedeliella graciliflora Herbário CGMS – nº 31.477 A.Pott –nº 15.369 Fazenda Modelo, Embrapa, Terenos, MS 20°33’24 1 S – 54°47’23.6 W

Crotalaria micans Herbário CGMS – _{nº 31.478} A.Pott –nº 11683 Fazenda Potreiro do Sucuriu, Costa Rica, MS

19°01’23 S –

53°11’34W

Ipomoea chiliantha Herbário CGMS – _{nº 31.479} A.Pott –nº 15.108

Passo do Lontra, Base de Estudos da UFMS, Corumbá, MS 19°34’32 S – 57°00’52 W

Senna splendida Herbário CGMS – _{nº 31.476} A.Pott –nº 6448

Fazenda Ipanema, Nhecolândia, Corumbá, MS

19°04’ S – 57°47’ W

Senna aculeata Herbário CGMS – _{nº 31.474} V.J.Pott –nº 6373 Fazenda Boa Sorte – Leque, Corumbá, MS

19°22’36 S –

57°02’51.1 W

Senna pendula Herbário CGMS – _{nº 31.475} A.Pott –nº 15.111 Estrada _{Corumbá, MS} Parque, 19°34’36 _57°01’06W S –

Indigofera truxillensis

Herbário: SPFR - nº 7922

SP Teixeira s/n Distrito de Rubião

3.2. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

Os solventes utilizados foram de grau técnico, purificados no laboratório, e de grau P.A.. As placas cromatográficas foram preparadas a partir da suspensão de gel de sílica 60 (GF254 – Merck) em água destilada, sendo a espessura de 0,25 mm para as placas comparativas e 0,75 mm para as placas preparativas.

Utilizou-se Sephadex LH-20 para a realização das colunas cromatográficas clássicas. Os reveladores utilizados na cromatografia em camada delgada foram: irradiação UV de 254 e 366 nm (método físico), NP-PEG, sulfato cérico, anisaldeído sulfúrico, KOH-5% em etanol e Dragendorf (métodos químicos).

Utilizou-se o ultrassom da marca Odontobrás, modelo 1440D. Utilizou-se centrífuga da marca Fanem®, modelo 206.

Utilizaram-se filtros Millipore LCR – 0,45µm da marca MillexTM.

Para efetuar a secagem de algumas frações foi utilizado o evaporador rotatório, sob pressão reduzida, da marca TECNAL, modelo TE-120.

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram obtidos através dos espectrômetros BRUKER DRX 500 e BRUKER DPX 300, com a utilização de solventes deuterados da marca Aldrich.

Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em um Espectrômetro de Massas UltrOTOFq (Bruker Daltonics) ESI-qTOF.

Para os ensaios farmacognósticos, utilizaram-se os reagentes: cloreto férrico, ácido clorídrico, ácido acético glacial, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, peróxido de hidrogênio, ácido 3,5-dinitrobenzoico, e os reagentes de Mayer, Bouchardat, Bertrand e Dragendorff. Todos os reagentes foram grau P.A.

As obtenções dos [αD] foram realizadas em Polarímetro digital, marca Jasco, modelo DIP-

370. As leituras foram realizadas em 589 nm.

Os espectros de dicroísmo circular (DC) foram obtidos em um Espectropolarímetro JASCO 810 (J 810-150s).

As análises por CG-EM foram realizadas em Cromatógrafo gasoso acoplado a Espectrômetro de Massas com modo de ionização por elétrons, marca Shimadzu, modelo GC- MS-QP2010. As análises foram realizadas utilizando-se coluna DB-5 MS e DB-1 MS (30m x

0,25mm x 0,25µm) e hélio como gás de arraste. Utilizaram-se as bibliotecas de espectros de massas Willey, NIST e de padrões do laboratório.

As análises em CLAE foram realizadas em cromatógrafo Shimadzu, modelo SCL-10AVP, equipado com três bombas Shimadzu, modelo LC-6AD, detector de arranjo de diodos UV-Vis DAD Shimadzu, modelo SPD-M10AVP, injetores manual e automático e sistema de integração computadorizada com software CLASS-VP. Foram utilizadas coluna analítica C- 18 (4,6 x 250 mm; 5 µm) e coluna semipreparativa C18 (20 x 250 mm, 5 µm) modelo SHIM- PACK PREP. ODS(H) KIT, Shimadzu. Foi utilizada também a pré-coluna ODS-8, Shimadzu.

As artemias (Maramar) e o sal marinho foram obtidos em loja especializada. Utilizou-se sal marinho para as culturas e dicromato de potássio como controle positivo.

As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (melanoma - humano), HCT-8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano), foram cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer (USA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37 °C e atmosfera contendo 5% de CO2.

Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo. Informações fornecidas pela

pesquisadora responsável pelo ensaio.

Utilizaram-se as cepas padrão provenientes da American Type Culture Collection de bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Enterococcus faecalis (ATCC 19433) e de bactérias Gram-negativas (Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e

Proteus mirabilis (ATCC 29906). As soluções das amostras foram preparadas em DMSO e

ágar Mueller Hinton, e os antibióticos estreptomicina e penicilina foram utilizados como controles positivos, em tampão fosfato de potássio. Cloreto de trifeniltetrazólio foi utilizado como agente revelador. Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços. Informações

fornecidas pela pesquisadora responsável pelo ensaio.

Na avaliação da atividade anti-alérgica, foram utilizadas células RBL-2H3, sensibilizadas pelo anti-DNP-IgE; tampão de Tyrode/BSA, o substrato 4-metil-umbeliferil-N-acetil-β-D- glucosaminida, Triton X-100; o fármaco de referência fumarato de cetotifeno, 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT); antígeno DNP-BSA, a sonda para Ca2+, Fluo 4-AM e sulfinpirazona. Informações fornecidas pela pesquisadora responsável pelo ensaio.

Na avaliação da atividade tripanocida, foram utilizadas Formas tripomastigotas da cepa CL B5, ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado. As contagens dos parasitos foram realizadas em hemocitômetro de Neubauer. Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços, sendo utilizado solução de CPRG (“chlorophenol red β-D-galactopyranoside”), e

tampão Triton X-100, pH 7,4. Informações fornecidas peo pesquisador responsável pelo

ensaio.

3.3. METODOLOGIA

3.3.1. Ensaios farmacognósticos

Os ensaios farmacognósticos foram realizados a partir de adaptações daquelas descritas por Matos, 1988 e Simões e colaboradores, 2004. Estes ensaios foram realizados para todas as plantas que constam neste estudo, à exceção de I. truxillensis. Foram obtidas maiores quantidades de material vegetal desta planta, o que permitiu optar por realizar o estudo químico clássico de cada órgão da planta em separado (raízes, caule, folhas e frutos). Porém, as massas obtidas referentes a cada uma destas partes da planta foram insuficientes para a realização dos ensaios farmacognósticos aqui descritos. Então, para esta espécie foram realizados ensaios específicos para algumas classes de substâncias tóxicas encontradas neste gênero, descritos nos itens 3.3.5 e 3.3.6.

I. chiliantha também foi avaliada quando a presença de substâncias específicas,

descritas no item 3.3.7.