Materiais e Métodos

2.1 Amostras de D. ecastaphyllum

Amostras de entrecasca de D. ecastaphyllum foram coletadas na margem sul do Rio São Francisco no município de Brejo Grande, Sergipe (S 10º46‟22” W 36º43‟54”) a 2Km de um apiário com produção confirmada de própolis vermelha; em uma ilha (S 10º45‟16” W 36º42‟58”); e na margem norte do Rio no estado de Alagoas (S10º43‟79” W 36º41‟94”). As amostras foram preparadas e depositadas no herbário da Universidade Federal de Sergipe sob o número 19310.

2.2 Extrato etanólico de D. ecastaphyllum (EED)

Amostras de entrecasca de D. ecastaphyllum foram secas em um forno de ar forçado a 40°C até completa desidratação, e em seguida, foram reduzidos a pó utilizando um moinho de facas. Os extratos foram preparados de acordo com Mendonça et al. (2015), com as seguintes modificações: 2 g de cada amostra foi submetida a extração com etanol 70 % (25mL) à temperatura ambiente durante 1 h em banho de ultrassom com agitação a cada 10 min. Após a extração, a mistura foi centrifugada e o sobrenadante evaporado sob pressão reduzida para se obter o extrato seco. Os extratos utilizados nas análises foram ressuspendidos em uma concentração de 5%.

2.3 Fenóis Totais e Flavonoides

O teor de fenóis totais nos EEDs foi determinado pelo método colorimétrico de Folin- Ciocalteu (SINGLETON et al., 1999). Os extratos (0,5 mL) foram misturados com 2,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu (1:10) e 2,0 mL de solução aquosa a 4% de Na2CO3. A absorvância foi medida a 740 nm após 2 horas de incubação à temperatura ambiente. Os EED foram avaliados a uma concentração final de 50µg/mL. O teor de fenóis totais foi expresso como mgEAG/g (equivalentes de ácido gálico). O teor de flavonoides nos extratos foi determinada usando um método descrito por Alencar et al. (2007), com modificações. Um total de 0,5 mL de EED (1:10), 1,5 mL de 95 % de etanol, 0,1 mL de 10% de AICI3, 0,1 mL de solução de acetato de potássio 1M e 2,8 mL de água destilada foram misturados. Após incubação de 40 min à temperatura ambiente, a absorvância foi medida a 415 nm. O teor de

flavonoides totais foram calculados como equivalentes de quercetina (mgEQ/g) a partir de uma curva padrão.

2.4 Purificação dos EED

A extração foi realizada utilizando métodos descritos por Silva et al. (2013), com a seguinte modificação: 5 mL EED foram homogeneizados individualmente com 5g de resina amberlit XAD-2 durante 10 min, com auxílio do bastão de vidro. As partículas de resina foi, em seguida, embalada em uma coluna de vidro (20 mm x 400 mm), lavou-se com água acidificada (pH 2 com HCl, 25 mL) e, subsequentemente, enxaguados com água ultrapura (25 mL) para remover todos os açúcares e outros componentes polares (FERRERES et al., 1996). As amostras foram então filtradas através de lã de vidro para remover quaisquer partículas sólidas. Os compostos fenólicos foram eluídos em 50 mL de metanol grau HPLC. Os extratos de metanol foram concentradas no rotaevaporador sob vácuo a 40°C. Após tratamento posterior, o resíduo foi dissolvido em 5 ml de água ultrapura e foi utilizado 5 ml de acetato de etila para capturar fenóis. O solvente foi removido por vácuo. O resíduo foi dissolvido em 2mL de metanol grau HPLC, filtrado (Millipore, 13 mm, tamanho de poro de 0,45) e armazenado em vials para análise cromatográfica subsequente.

2.5 HPLC

As análises cromatográficas dos extratos etanólicos (25mg/mL) foram realizadas em um HPLC Shimadzu Co modelo Prominence, consistindo de amostrador automático, bomba binária (LC-20AT), forno de coluna (CTO-20A) e detector diodos DAD (SPD-M 20A). A medição foi realizada de acordo com o método descrito por Cabral et al. (2009) e Alencar et al. (2007) com as modificações da taxa de fluxo: 1,0 mL / min; temperatura 35°C; coluna: Phenomenex (Luna 5u C18 (2) 100A, 250 x 4,6mm); volume de injeção, 20 µl; fase móvel, A = 5% de ácido acético (aq), B = metanol; gradiente de eluição, 10-20% de B, 0-10 min; 20- 60% de B, 65 min; 80% de B, 70 min; 80% de B, 75 min; 20% de B, 80 min; detecção, por arranjo de diodos (k = 200 e 400 nm). Todos os eluentes utilizados foram grau HPLC (VWR International S.A.S.). Os padrões utilizados foram: ácido abscísico, ácido ascórbico, ácido cafeico, ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido gálico, ácido p-cumárico, ácido protocateicuico, trans-cinâmico, ácido vanílico, apigenina, biochanina A, daidzeína, formononetina, liquiritigenina, isoliquiritigenina, Caempferol, luteolina, naringerina, quercetina, rutina e triacetina. Os compostos foram identificados com base no comportamento cromatográfico em comparação com padrões externos. Cada composto foi quantitativamente

analisado por uma curva padrão, construída a partir de cromatogramas HPLC dos compostos autênticos.

2.6 Determinação da atividade antioxidante pelo método ORACFL

A atividade antioxidante dos EEDs foi medida usando o teste ORACFL (capacidade absorvente do radical oxigênio) com fluoresceína como sonda fluorescente e AAPH (cloreto de (2,2'-azobis (2-amidiopropano)) como uma fonte de radicais livres. As experiências foram realizadas em placas de microtitulação de 96 poços de acordo com a metodologia descrita por Prior et al. (2003) e Ou et al., (2001). Para esta finalidade soluções estoque foram preparadas a partir de EED (50 mg.mL-1), em EtOH/DMSO (50:50) e diluiu-se 100, 500, 1000, 5000 e 10000 vezes com tampão de fosfato (pH 7,05). Foi adicionado 50 µL de cada diluição nos poços com 100 µl de fluoresceína e, finalmente, 50 µL de AAPH. O Trolox (6-hidroxi-2, ácido 5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico) que é um análogo da vitamina E, foi usado como substância de referência. A leitura foi realizada utilizando um filtro de fluorescência (excitação λ = 485 nm e emissão λ = 528nm) monitorando a cinética da reação a cada 2 min durante um período de 70 minutos (temperatura = 37°C). Os resultados foram expressos como µmol de Trolox equivalente (ET) por grama de extrato (µmol ET/g). Como controle positivo foi utilizado a quercetina e como controle negativo e solução diluente.

2.7 Ensaio Biológico

Microrganismo: Cepas foram fornecidas pelo Laboratório de Biomateriais do Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Universidade Tiradentes. Foram utilizadas duas linhagens clínicas bacterianas (Staphylococcus aureus (Gram +) e Pseudomonas aeruginosa (Gram -)).

Atividade antibacteriana: Foi realizada de acordo com Mendonça et al. (2011). Foram preparadas as suspensões das bactérias e ajustada de acordo com o padrão de turvação em comparação com a escala 0,5 McFarland (1,5 x 108 células/ml). Método de difusão de ágar foi utilizado para a determinação das atividades antibacterianas de EED. Após a solidificação das placas à temperatura ambiente, foram feitos poços (d=5mm). Alíquotas de 40 µl de EED (50 mg.ML- 1) foram adicionados aos poços. As placas inoculadas foram incubadas durante 24 h a 35°C. Zonas de inibição foram expressos em (mm). Todos os testes foram realizados em triplicata.

2.8 Análise estatística

Foi realizado a análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de Tukey a fim de avaliar a diferença entre os grupos. Os valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Estas análises foram feitas usando o software Assistat 7.7 beta.