Detecção molecular de Erwinia psidii em goiabeiras em casa de-vegetação e campo
MATERIAIS E MÉTODOS
Detecção temporal de Erwinia psidii em goiabeiras inoculadas em casa de vegetação
BIO-PCR
Para a inoculação de E. psidii, foram utilizadas 20 mudas sadias de goiabeira da variedade Pedro Sato, com pelo menos 6 brotos cada, mantidas em casa de vegetação em vasos, sob temperaturas variando de 23 a 30 ºC. O experimento foi realizado seguindo um delineamento experimental casualizado com quatro tratamentos e quatro plantas (sendo cada planta correspondendo a uma repetição) por tratamento, sendo três inoculadas e uma testemunha. Cada tratamento correspondeu aos tempos 0, 5, 10 e 15 dias após a inoculação.
As mudas foram inoculadas com uma suspensão a 107 ufc/mL do isolado IBSBF 1576 de E. psidii, cultivado em meio 523 por 24 horas a 29 ºC. Este isolado foi escolhido para os ensaios por ser virulento, conforme ensaios preliminares, e por ter sido coletado em um pomar de Brazlândia, no DF, em 2001. A inoculação das mudas foi feita a partir de um pequeno ferimento na axila do primeiro par de folhas totalmente expandidas com o auxílio de agulha hipodérmica. Em seguida, foi depositada sobre o ferimento uma gota de uma suspensão bacteriana. Foram inoculados seis brotos em cada planta. Após a inoculação, os brotos inoculados foram cobertos com saco plástico e
56 permaneceram sob câmara úmida por 72 horas. As plantas mantidas como testemunhas foram pulverizadas com água destilada estéril.
A partir do tempo zero, coletou-se amostras de brotos de cada uma das três plantas inoculadas e da testemunha não inoculada, que foram submetidas aos métodos de BIO-PCR e PCR convencional.
O método de BIO-PCR foi realizado com os iniciadores Ep2L/2R, específicos para E. psidii (Capítulo 2) e consistiu em macerar em 2 mL de água destilada estéril os tecidos dos brotos em cadinhos estéreis e, desse macerado, alíquotas de 100 µL foram plaqueadas em meio de cultura 523 (Kado & Heskett, 1970), em triplicatas. Decorridas 24 horas, as placas foram lavadas com 2 mL de água destilada estéril, recuperando-se 1 mL dessa suspensão que, em seguida, foi diluída na proporção de 1:10. Dessa diluição, foram retirados 3 µL para amplificação por PCR. As reações de amplificação foram compostas por tampão 1X (50 mM de KCl, 10 mM Tris HCl), 1,25 mM de MgCl2, 0,1 mM de
dNTPs, 0,5 µM de cada iniciador, Ep 2L (3’ CCAAAAAGCTTGGTGTGGATA 5’) e Ep 2R (3’ AAATTGGTGACTCGCACATG 5’) e, 0,5 U de Taq DNA polimerase e 30 ηg de DNA purificado de E. psidii IBSBF 435 ( para o controle positivo). O volume de água destilada estéril foi ajustado para 25 µL de reação.
O programa utilizado para a amplificação foi composto pelas etapas de desnaturação a 95 ºC por 3 minutos, seguido por 32 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 64 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 2 minutos e 72 ºC por 5 minutos no termociclador PT-100 (M J Research. Inc.). Foram utilizados como controles positivos uma suspensão bacteriana a 106 ufc/mL e DNA purificado de E. psidii e como controles negativos extrato de folhas de goiabeira sadia e reação livre de DNA da bactéria.
PCR Convencional
Após a coleta dos tecidos dos brotos, procedeu-se o corte dos mesmos em pequenos fragmentos que foram colocados em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL, contendo de 5 mL de água destilada estéril, deixando-se por 1 hora a 200 rpm em agitador horizontal. Após agitação, o lavado foi centrifugado por 10 minutos a 13.200 rpm. Descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 250 µL de tampão gelado do kit Pathoscreen® (Agdia), a base de sulfito de sódio, azida sódica, polivinilpirrolidona e albumina e realizou-se duas diluições 1:10 e 1:100. Procedeu-se
57 PCR com iniciadores Ep 2L/2R adicionando-se 3 µL de cada diluição na reação. Controles negativos, positivos e condições para PCR foram preparados conforme descrito acima.
Detecção de Erwinia psidii por PCR em goiabeiras sintomáticas e assintomáticas de pomares do Distrito Federal.
Foram escolhidas aleatoriamente três propriedades em Brazlândia, DF, com pomares de goiabeira da variedade Pedro Sato e com histórico de seca dos ponteiros. Entre janeiro e fevereiro de 2011, foram coletadas, em cada um dos pomares, 40 amostras sendo 20 constituídas de brotações sem sintomas aparentes e 20 de brotações com sintomas de murcha e enegrecimento dos brotos. Em alguns casos, devido à dificuldade de se encontrar plantas sadias, coletou-se brotações sadias de plantas doentes. Após a coleta, as amostras foram armazenadas em sacos plásticos em câmara fria (4ºC) até o processamento por BIO-PCR, conforme o protocolo descrito acima.
RESULTADOS
Detecção temporal de Erwinia psidii em goiabeiras inoculadas em casa de vegetação
A partir do tempo zero, obteve-se amplificação positiva das amostras de todas as plantas inoculadas, tanto por PCR quanto pelo método de BIO-PCR (Tabela 1). A partir do quinto dia, sintomas de encharcamento e enegrecimentos das nervuras já podiam ser observados e tornaram-se bastante evidentes aos 10 dias (Figura 1B). Aos 15 dias, as plantas inoculadas exibiam sintomas de murcha e enegrecimento com início de necrose dos brotos. Todas as plantas inoculadas com água geraram resultado negativo para PCR e BIO-PCR (Figuras 1 e 2)
58 Tabela 1- Detecção de Erwinia psidii por PCR e BIO-PCR em mudas de goiabeira inoculadas em casa de vegetação em relação ao tempo e aparecimento de sintomas
Tempo
(dias após inoculação) Sintomas PCRc BIO-PCR
0 - 6/6 9/9
5 +a 6/6 9/9
10 + 6/6 9/9
15 ++b 6/6 9/9
a
sintoma de encharcamento e início de enegrecimento das nervuras; b sintoma de necrose dos brotos;
c
.número de reações positivas em relação ao total de amostras. Para cada tempo, foram amostradas 3 plantas com reações em duplicata para PCR e em triplicatas para BIO-PCR.
Figura 1 – A: Eletroforese em gel de agarose a 1 %, mostrando os produtos da BIO-PCR com iniciadores
Ep2L/Ep2R, de plantas de goiabeira inoculadas com Erwinia psidii (IBSBF 1576), após 10 dias da inoculação, sendo: M-Marcador 100 pb (Promega), CN- Controle negativo da PCR, CPS- Controle positivo com suspensão de células bacterianas, CPD- Controle positivo com DNA purificado, CNF- Controle negativo de folhas inoculadas com água estéril. Cada amostra corresponde a uma planta inoculada, com três repetições de cada no gel. B: planta inoculada mostrando início de necrose na axila e murcha da brotação aos 10 dias da inoculação.
500 pb
600 pb
M CN CPS CPD CNF BROTOS INOCULADOS
BROTOS INOCULADOS
59
Figura 2 – A: Eletroforese em gel de agarose a 1 %, mostrando os produtos da PCR convencional com
iniciadores Ep2L/Ep2R, de plantas de goiabeira inoculadas com Erwinia psidii (IBSBF 1576), após 10 dias da inoculação, sendo: M-Marcador 100 pb (Promega), CN- Controle negativo da PCR, CPS- Controle positivo com suspensão de células bacterianas, CPD- Controle positivo com DNA purificado, CNF- Controle negativo de folhas inoculadas com água estéril. Cada amostra corresponde a uma planta inoculada, com duas repetições de cada no gel.
Detecção de Erwinia psidii por PCR em goiabeiras sintomáticas e assintomáticas de pomares do Distrito Federal.
Os três pomares visitados na região de Brazlândia, DF, possuíam histórico de ocorrência da seca-dos-ponteiros (Tabela 2). Na primeira saída de campo, observou-se um pomar muito atacado, com plantas apresentando sintomas típicos de seca dos ponteiros e baixa incidência de plantas com brotações sadias. Das 40 amostras coletadas, detectou-se a presença de E. psidii por BIO-PCR em 18 das 20 amostras com sintomas, e em apenas três das amostras sem sintomas visíveis (Tabela 3).
No segundo pomar também se observou a maioria das plantas de goiabeira afetadas pela seca dos ponteiros. Do total de amostras coletadas com sintomas, confirmou-se a presença do patógeno em 100% delas por BIO-PCR. Entre as 20 amostras sem sintomas, apenas uma foi positiva.
O terceiro pomar visitado havia sido estabelecido há três anos, e já apresentava incidência da doença. Confirmou-se a presença da bactéria em 100% das amostras com
M CN CPS CPD CNF Brotos inoculados
60 sintomas, mas em nenhuma das amostras sem sintomas (Figura 3, Tabela 3). Dentre as amostras com sintomas, nem todas foram positivas inicialmente (Figura 3C). Com essas amostras, realizou-se então uma nova diluição dos lavados, de 1:100, o que resultou em PCR positiva para todas.
Tabela 2 – Informações referentes às propriedades escolhidas para validação do método de BIO-PCR para detecção de Erwinia psidii em goiabeiras
Área Cultivar Idade do
Pomar
Última poda
Irrigação Histórico da doença * Pomar 1 Pedro Sato 13 anos 15/2/2011 aspersão 2004
Pomar 2 Pedro Sato 11 anos 17/2/2011 aspersão 2004 Pomar 3 Pedro Sato 3 anos 20/2/2011 aspersão Recente *época da primeira constatação
Tabela 3 – Detecção de Erwinia psidii por BIO-PCR em pomares de goiabeira no Distrito Federal, 2011
BIO-PCR
Com Sintomas Sem Sintomas Pomar 1 18a/20b 3/20 Pomar 2 20/20 1/20 Pomar 3 20/20 0/20 Total 58/60 4/60
Com sintomas – Amostras com sintomas de murcha e enegrecimento. Sem sintomas – Amostras sem sintomas visíveis. a- Número de amostras positivas para BIO-PCR. b- Número total de amostras coletadas e analisadas.
61
Figura 3 – A, B e C - BIO-PCR para detecção de Erwinia psidii em pomares de goiabeiras no município de Brazlândia, DF,
referente ao pomar 3. A) 1- controle negativo da PCR; 2- controle negativo com folhas sadias, 3- controle positivo de suspensão bacteriana do isolado IBSBF1576, 4- controle positivo de DNA desse isolado; 5 a 19: na parte superior e inferior, amostras dos brotos sem sintomas; B) e 1 a 7 em B: amostras de brotações sem sintomas 8 a 17 na parte superior e inferior, amostras de brotações coletados com sintomas;.C) 1-12: amostras de brotações coletadas com sintomas; D) Ramo com sintomas de necrose e mumificação nas brotações.
A
C
D
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 151617 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 1617 18B
Amostras sem sintomas Amostras sem sintomas
Amostras sem sintomas Amostras com sintomas
Amostras com sintomas
Amostras com sintomas 500 pb
62
Figura 4 - BIO-PCR para detecção de Erwinia psidii em pomares de goiabeiras no município de Brazlândia, DF, referente ao pomar
1. 1- controle negativo da PCR; 2- controle negativo com folhas de goiabeira sadias, 3- controle positivo de suspensão bacteriana do isolado IBSBF1576, 4- controle positivo de DNA desse isolado; na parte superior e inferior, amostras dos brotos sem sintomas.
DISCUSSÃO
Frente à necessidade de métodos para detecção de patógenos que afetam a produtividade de fruteiras, em especial da cultura da goiaba, foi desenvolvido o método de BIO-PCR empregando-se iniciadores específicos para E. psidii.
Os ensaios realizados em casa de vegetação com mudas inoculadas mostraram o potencial de detecção de E. psidii nos primeiros estágios após infecção pelos dois métodos testados. A primeira coleta foi feita de 4-6 horas após a inoculação (tempo zero), já resultando em detecção positiva por PCR e BIO-PCR. Após 72 horas da inoculação, já se observava sintomas de encharcamento próximos ao sítio de inoculação. A detecção positiva em tecidos assintomáticos inoculados com suspensão a 107 ufc/mL era esperada, considerando-se a sensibilidade dos métodos já determinada anteriormente.
Após coletas realizadas em três pomares com histórico de ocorrência da seca dos ponteiros, pode-se comprovar a eficácia da BIO-PCR, na detecção de 96,7 % das amostras com sintomas e de 6,7 % das amostras sem sintomas. Do total de 60 amostras
M 1 2 3 4
Amostras assintomáticas
Amostras assintomáticas
63 com sintomas de seca, escurecimento e murcha nas brotações novas, duas foram negativas. Isto pode ser explicado pelo fato de que descolorações naturais da planta ou deformações de causas diversas podem ser confundidas com sintomas da bacteriose (Coelho et al.,2002). Marques et al. (2007) observaram uma correlação de 81,9% entre a presença de sintomas (detecção visual) e o diagnóstico laboratorial (isolamento da bactéria em meio de cultura). A correlação entre detecção visual e BIO-PCR foi, portanto, superior àquela observada por esses autores. Deve-se considerar também a possibilidade de escape em função da distribuição da bactéria no tecido ou por falhas no procedimento.
Do total das 60 amostras sem sintomas aparentes, apenas quatro resultaram em detecção positiva por BIO-PCR. Nesse caso, árvores amostradas estariam realmente livres da bactéria nos tecidos coletados, embora a bactéria pudesse estar presente na planta. Outra situação possível seria a população bacteriana presente estar abaixo do limite de detecção do método. Métodos mais sensíveis como PCR em tempo real (Weller et al., 2006) poderiam ser usadas para melhorar os níveis de detecção em plantas assintomáticas. Outra possibilidade é o uso de Nested-PCR (Lopéz et al., 2009) embora o tamanho da sequencia alvo, de cerca de 200 pb, limite o desenho de iniciadores internos para sua aplicação. Uma outra possibilidade seria a da presença de inibidores não removidos na etapa de enriquecimento em meio de cultura, que impediriam a amplificação. Considerando os altos índices de detecção nas amostras com sintomas, isto seria pouco provável. Uma forma de assegurar que a reação tenha ocorrido na ausência de inibidores seria o uso de um controle interno tal como relatado por Midorikawa et al. (2008).
O método aqui descrito e validado em pomares do DF constitui-se uma ferramenta que poderá ser usada também para estudos epidemiológicos da doença, para determinar a longevidade de E. psidii em restos de cultura infectados e sua possível sobrevivência no solo ou mesmo associada a plantas hospedeiras alternativas ainda não conhecidas e sua translocação em plantas de goiabeira.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas. Phytopathology 60: 969-976.
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Marques ASA, Coelho MVS, Ferreira MASV, Damasceno JPS, Mendes AP, Vieira TM (2007) Seca dos ponteiros da goiabeira causada por Erwinia psidii: níveis de incidência e aspectos epidemiológicos.Revista Brasileira de Fruticultura, 29: 488-493.
Midorikawa GEO, Pinheiro MRR, Vidigal BS, Arruda MC, Costa FF, Pappas Jr GJ, Ribeiro SG, Freire F, Miller RNG (2008) Characterization of Aspergillus flavus strains from Brazilian Brazil nuts and cashew by RAPD and ribosomal DNA analysis. Letters in Applied Microbiology 47: 12 – 18.
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Rosato YB, Gonçalves ER, Tahara ST, Metha A (2002) Diagnóstico molecular de doenças em plantas: detecção de fitopatógenos bacterianos. In: Serafini LA, Barros NM, Azevedo JL (2002) Biotecnologia: avanços na agricultura e na agroindústria. Editora EDUCS.
Weller AS, Elphinstone JG, Parkinson N, Thwaites R (2006) Molecular diagnosis of plant pathogenic bacteria. Arab Journal of plant protection 24: 143 – 146.
65 ANEXOS
Meio de cultura 523 (Kado & Heskett, 1970) Sacarose 10 g
Extrato de levedura 4 g Caseína ácida hidrolisada 8 g K2HPO4 (anidro) 2g
MgSO4 0.3 g
Agar 17, 0 g
Completar com água destilada para 1000 mL
Tampão de cobertura para ELISA Carbonato de sódio 0,05 mol dm-3, ph 9,6 Tampão PBST (1X)
Dissolver em 1000 mL de água destilada: Cloreto de Sodio 8.0 g
Fosfato de Sódio dibásico (anidro) 1.15 g Fosfato potassio monobásico (anidro) 0.2 g Cloreto de potássio 0.2 g
Tween-20 0.5 g Ajustar o pH para 7.4
Tampão geral de extração (GEB 1X) Dissolver em 1000 mL de 1X PBST: Sulfito de sódio (anidro) 1.3 g
Polyvinylpyrrolidone (PVP) MW 24-40,000 20.0 g Azida sódica 0.2 g
Powdered egg (chicken) albumin, Grade II 2.0 g Tween-20 20.0 g
Ajustar o pH para 7.4. Armazenar a 4°C.
66 PROTOCOLO PARA DETECÇÃO DE ERWINIA PSIDII EM GOIABEIRA POR BIO-PCR
1. Coletar folhas/brotos com ou sem sintomas e pesar aproximadamente 1 g do tecido vegetal.
2. Macerar o tecido em água destilada (2 mL para1 g de tecido).
3. Plaquear 100 µL do macerado em meio 523 e incubar a 29 °C por 24 horas. 4. Lavar a placa adicionando 2 mL de água destilada estéril e juntar o conteúdo em
um canto da placa com auxilio de alça de Drigalsky.
5. Retirar 1 mL desse lavado e colocar em microtubos Eppendorf.
6. Fazer uma diluição de 1:10 em água destilada estéril. Dessa diluição, retirar 3 µL para a PCR.
7. Realizar a PCR com os iniciadores Ep 2L (3’ CCAAAAAGCTTGGTGTGGATA 5’) e Ep 2R (3’ AAATTGGTGACTCGCACATG 5’) e com os seguintes componentes: tampão 1X (50 mM de KCl, 10 mM Tris HCl), 1,25 mM de MgCl2, 0,1 mM de dNTPs,
0,5 µM de cada iniciador, 0,5 U de Taq DNA polimerase e 3 µL do lavado da placa. O volume de água destilada estéril deve ser ajustado para 25 µL de reação.
8. Incluir como controles positivos: suspensão bacteriana de cultura pura de
Erwinia psidii e DNA purificado de um isolado de E. psidii.
9. Incluir como controles negativos: reação livre de DNA e macerado de folha sadia de goiabeira.
10. Utilizar programa composto pelas etapas de desnaturação a 95 ºC por 3 minutos, seguido por 32 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 64 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 2 minutos e 72 ºC por 5 minutos.
11. Preparar gel de agarose a 1% em cuba para eletroforese e proceder a corrida a 90 V em TBE 0,5 X por 1 hora.
12. Analisar 10-12 µL da reação misturada ao tampão de carregamento (3 µL) e aplicar um marcador adequado (p. ex. 100 bp DNA ladder).
13. Após corrida, corar o gel com brometo de etídeo (1 µg/mL), visualizar em transluminador e fotodocumentar.
14. Considerar positiva a amostra que gerar um fragmento de aproximadamente 200 pb.