5.1Localização
O experimento foi conduzido na Fazenda Experimental de São Manuel da Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Ciências Agronômicas, em São Manuel-SP, com as seguintes coordenadas geográficas: Latitude a 22°44’00” sul. longitude, 48°34’00”, altitude de 740 m sobre o nível do mar. O clima é classificado como do tipo Mesotérmico Cwa, ou seja, subtropical úmido com estiagem no período do inverno, conforme o sistema internacional de Köppen (SETZER, 1946)
A análise química do solo foi realizado pelo Laboratório de Fertilidade do solo do Departamento de Recursos Naturais / Ciências do solo da Unesp Campus de Botucatu, e as características químicas na faixa de 0 a 20 cm de profundidade estão demonstradas na Tabela 1.
Tabela 1. Características químicas do solo. São Manuel-SP, 2010.
pH M.O Presina H+Al K Ca Mg SB CTC V%
CaCl2 g dm-3 mg dm-3 --- --- mmolcdm-3 --- --- --- ---
6,8 12 216 1,9 55,5 7 64 73 88
B Cu Fe Mn Zn
--- --- mg dm-3 --- ----
0,20 1,7 16 7,2 8,3
O delineamento experimental utilizado foi o de parcelas subdivididas no esquema fatorial 4X4 com três repetições, no qual testou-se quatro doses de piraclostrobina (zero, 0.050, 0.075 e 0.1 L.ha-1) e quatro de deficiência hídrica (-10, -20, -30 e- 40 kPa) em dois momentos, inicio da fase reprodutiva R5, ou seja na abertura do primeiro botão floral e R7no inicio da fase de enchimento de vagens.
Utilizou se do Fungicida CometR com 250g.L-1 de piraclostrobina, fabricado pela BASF, sendo este um fungicida sistêmico do grupo químico das estrobilurinas sendo recomendado para a cultura do feijão no controle da Mancha angular (Phaeoisariopsis griseola), Antracnose (Colletrotrichum lindemuthianum) e ferrugem (Uromyces appendiculatus) para as três doenças recomenda-se a dose de 0.3L.ha-1 do fungicida.
A variedade cultivada de feijão utilizada foi a Carioca Precoce, de crescimento determinado de porte prostrado, com ciclo médio de 70 a 90 dias, resistente ao mosaico-dourado e suscetível a doenças como Mancha angular (Phaeoisariopsis griseola), Antracnose (Colletrotrichum lindemuthianum) e ferrugem (Uromyces appendiculatus).
5.2 Semeadura e irrigação
A semeadura foi realizada no dia 22 de outubro de 2010, em estufa tipo túnel com 40m de comprimento por 7m de largura, em canteiros de 2X5m construídos transversalmente no interior da casa de vegetação, a população de plantas utilizada foi de 250.000 plantas.ha-1 com o espaçamento de 40cm entre linhas e 12,5 sementes por metro
O sistema de irrigação utilizado foi a do tipo localizada, com o gotejo equidistante a 20 cm na linha de semeadura e incluindo uma linha principal de onde saíam às fitas gotejadoras de modo a deixar uniforme a distribuição de água no canteiro. O fluxo de água era controlado por pequenas torneiras no inicio de cada fita, podendo se assim interromper a irrigação do canteiro no momento previsto. Um conjunto de Tensiômetros foi instalado para quantificar o potencial hídrico do solo.
5.3 Aplicação dos tratamentos, coleta de material vegetal e avaliações fotossintéticas.
A piraclostrobina foi aplicada via pulverização foliar utilizando-se um pulverizador de barras com pressão de CO2 e bico do tipo leque (110-02).
A primeira aplicação da piraclostrobina foi em R5 e logo após iniciou- se o tratamento de estresse hídrico. Nesta fase fez-se coletas de material vegetal para a quantificação das enzimas superóxido dismutase, catalase, e peroxidase no final de cada nível de deficiência hídrica aplicada.
A segunda aplicação do produto aconteceu no momento em que as plantas estavam iniciando o estádio R7 (inicio do enchimento das vagens) após a aplicação dos respectivos estresses hídricos na cultura. Três dias após a aplicação da piraclostrobina avaliou- se as variáveis de trocas gasosas, taxa de assimilação de CO2 (A), transpiração, condutância (E), concentração interna de CO2 (Ci), Transpiração e foi estimado a atividade da Rubisco através da eficiência instantânea de carboxilação (A/Ci), com o uso do “infra red gas analiser” (IRGA) e a área foliar.
As medidas foram calculadas a partir da diferença entre a concentração de CO2 e vapor d’água do ar da referencia (valor presente na câmara sem folha) e da amostra
(valor com a folha presente na câmara), obtendo-se as concentrações de vapor d’água e CO2
que foram liberados (transpiração – vapor d’água) e assimilados (assimilação de CO2) pelos
estômatos das folhas.
5.4 Senescência, massa seca e produtividade
Aos 64, 71 e 79 DAE fez se a contagem das folhas senescentes para caracterizar a ação da piraclostrobina e da deficiência hídrica na senescência das plantas.
Caracterizou-se as folhas senescentes quando esta apresentava-se em tom amarelado e seco. No final do ciclo realizou-se a obtenção da massa seca das plantas e produtividade.
A Produtividade foi estimada pela fórmula: R = (P . Vp . Gv . M)/1000
Onde:
R = produtividade de grãos (kg.ha-1)
P = população de plantas (180 a 240 mil plantas há-1)
Vp = nº de vagens planta Gv = nº de grãos vagem M = massa de 100 grãos
5.5 Determinação enzimática.
5.5.1 determinação da atividade da SOD (SOD, EC 1.15.1.1)
A determinação da atividade da SOD considera a capacidade da enzima em inibir a fotorredução do NBT (Azul de Nitrotetrazólio Cloreto). A atividade foi determinada pela adição de 50 μL de extrato bruto a uma solução contendo 13 mM de metionina, 75 μM de NBT, 100 nM de EDTA e 2 μM de riboflavina em 3,0 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.8.
A reação foi iniciada pela iluminação dos tubos, em câmara composta por tubos fluorescentes (15 W), a 25°C. Após 8 minutos de incubação, o final da catálise foi determinada pela interrupção da luz (GIANNOPOLITIS & RIES, 1977). O composto azul formado (formazana) pela fotorredução do NBT foi determinado pelo incremento na absorção a 560 nm. Os tubos considerados brancos para a análise receberam os mesmos reagentes, porém foram mantidos cobertos com papel alumínio, portanto, abrigados da luz. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para a inibição de 50% da fotorredução do NBT. Para o cálculo da atividade específica da enzima, considera-se a percentagem de inibição obtida, o volume da amostra e a concentração de proteína na amostra (μg / μL).
5.5.2 Determinação da catalase (CAT) (CAT, EC 1.11.1.6).
Para a determinação da atividade da CAT, o sistema de reação por 80 segundos, foi composto de 50 μL de extrato enzimático, tampão fosfato de sódio 0,05 mol.L- 1, pH 7,0 e12,5 mmol.L-1 de H2O2, num volume final de 1 mL-1 Após leituras de absorbância a 240 nm, utilizou-se para os cálculos o coeficiente de extinção molar de H2O2 (39,4 mmol.L-1.cm-1) a atividade da enzima foi expressa em nmol de H2O2 consumido.min- 1.mg-1 proteína (PEIXOTO et al, 1999).
5.5.3 Determinação da peroxidase (POD) (PODS, EC 1.11.1.7).
A atividade da POD foi determinada de acordo com as condições citadas no trabalho de Teisseire e Guy (2000). O sistema de reação foi composto de 30 μL de extrato enzimático diluído (1:10 em tampão de extração); tampão fosfato de potássio 50mmol L-1, pH 6,5; pirogalol (1, 2, 3-benzenotriol) 20 mmol L-1 e peróxido de hidrogênio (H
2O2) 5
mmol L-1, totalizando um volume de 1,0 mL. A reação foi conduzida a temperatura ambiente por 5 minutos. A formação de purpurogalina foi medida em espectrofotômetro UV-visível a 430nm e o seu coeficiente de extinção molar (2,5nmol.L-1 cm-1) foi usado para calcular a atividade específica da enzima, expressa em μmol de purpurogalina.min-1,mg-1 de proteína.