Animais
As experiências foram realizadas em ratos jovens Wistar de ambos os sexos (152- 498g), adquiridos no Biotério da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa (FCM-UNL). Os animais foram mantidos com controlo de temperatura e humidade (21 ± 1°C; 55 ± 10% humidade), com ciclos de 12h luz – 12h escuridão. Na véspera do protocolo experimental, os animais foram submetidos a um jejum noturno (> 8 horas), com livre acesso à água. Na manhã seguinte os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico 60 mg/kg e foi realizado o protocolo experimental. Todos os procedimentos foram executados de acordo com a diretiva da União Europeia, “European Union Directive for Protection of Vertebrates Used for Experimental and Other Scientific Ends” (2010/63/EU) e foram previamente aprovados pelo Comité de Ética da FCM-UNL.
12 Estudo do efeito de adenosina na libertação de óxido nítrico
De modo a avaliar os efeitos de adenosina na libertação de óxido nítrico na insulinorresistência, os ratos foram divididos em 2 grupos: (1) grupo controlo e (2) grupo com uma dieta rica em sacarose (HSu), um modelo magro que combina resistência à insulina e hipertensão. O grupo controlo tinha livre acesso à agua e a uma dieta standard com 7,5% gordura + 75% carbohidratos (4% açúcar) + 17% proteína (SDS diets RM1, probiotica, Portugal). Por sua vez, no grupo HSu, a os animais foram submetidos uma dieta sólida standard durante 28 dias, mas adicionou-se 35% de sacarose na água (p/v). Para estudar qual(ais) o(s) subtipo(s) de recetores de adenosina que poderiam estar envolvidos em alterações na libertação de óxido nítrico, os ratos, após anestesia, foram sacrificados e os tecidos, fígado, tecido adiposo visceral e o músculo-esquelético soleus foram extraídos e incubados in vitro durante 3 tempos distintos, 10, 30 e 60 minutos, numa solução de tyrode bicarbonato a pH 7,4, composta por: NaCl 116mM; KCl 5mM; CaCl2 2mM; MgCl2 1,1mM;
HEPES 10mM; Glucose 5,5mM; NaHCO3 24mM (gaseada em condições de normóxia com
20% de O2, 5% de CO2 e 75% de N2). Os tecidos foram incubados na presença ou na ausência
dos seguintes agonistas dos recetores de adenosina: CPA: agonista dos recetores de adenosina A1, com as concentrações de 3 e 30nM; CGS-21680, agonista dos recetores de adenosina A2A,
com as concentrações de 30 e 100nM; BAY-60-6583 e agonista dos recetores A2B, com as
concentrações de 100nM e 1µM. (figura 5):
Figura 5- Esquema representativo das incubações realizadas, na presença ou na ausência de diferentes concentrações dos
agonistas dos recetores de adenosina, BAY-60-6583 (agonista dos recetores de adenosina A2B), CPA (agonista dos recetores
de adenosina A1) e CGS-21680 (agonista dos recetores de adenosina A2A).
Para proceder à quantificação de NO nas amostras, estas foram pesadas (Mettler Toledo, Portugal) e homogeneizadas num homogeneizador automático (Heidolph, Alemanha) em tampão Tris-HCl pH 7.4 com 10 mM EDTA e 10 mM EGTA.
Depois de homogeneizadas, os fígados e músculo-esqueléticos foram centrifugados (Eppendorf, Espanha) a 13,000g, durante 20 minutos, a 4°C. Retirou-se o sobrenadante e procedeu-se à desproteinização das amostras. No caso do tecido adiposo, antes da desproteinização, procedeu-se à recolha do sobrenadante e a uma nova centrifugação deste de 13,000g, durante 10 minutos, a 4°C. Para a desproteinização diluiu-se o sobrenadante com etanol absoluto (3x volume a 4°C). Agitou-se no vórtex e colocou-se em gelo durante 30 minutos. Após este período, centrifugou-se a amostra a 13,000g, durante 15 minutos, e recolheu-se o sobrenadante.
O NO contido então nos homogeneizados, foi determinado por quimioluminescência, utilizando um analisador de NO (Sievers 280TM NO analyser, Sievers Instruments, EUA), no qual os nitritos e nitratos são reduzidos a NO quando em contacto com o cloreto de vanádio III (VCl3) a 90ºC. O NO, formado em reação com o ozono, emite um fotão que é detetado
num fotomultiplicador que, por sua vez, emite um sinal elétrico que é quantificado. Os resultados são apresentados em μM/grama de tecido (para mais pormenores sobre os métodos ver anexo IV).
Análise por Western blot da expressão proteica da iNOS
Os tecidos, fígado e o músculo soleus, foram homogeneizados num homogeneizador automático (Heidolph, Alemanha), sendo que as amostras referentes a músculo-esquelético
soleus (50mg) foram homogeneizadas em meio Zurich (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM; NaCl
150mM; Triton X-100 1%; Colato de sódio 1%; SDS 1%), ao qual foi adicionado um cocktail de inibidores de proteases (tripsina, pepstatina, leupeptina, aprotinina ortovanadato de sódio, PMSF). As amostras de fígado (0,1g), por sua vez, foram homogeneizadas num tampão com Tris-HCl 100mM; EGTA 0.2 M; EDTA 0.2 M; Triton-x 100; Sucrosa 0.27 M; suplementado com o mesmo cocktail de inibidores de proteases.
Após a homogeneização, as amostras foram centrifugados (Eppendorf, Madrid, Espanha) a 13000g, durante 20 minutos. Procedeu-se, de seguida, à recolha do sobrenadante, que foi congelado a -80ºC até posterior utilização.
A concentração de proteína dos homogeneizados foi determinada através de um método colorimétrico Micro-BCA (Pierce, Madrid, Espanha).
As amostras dos homogeneizados (50μg) e de marcadores de peso molecular conhecido (Precision, Biorad, Madrid, Espanha) foram separadas por SDS-PAGE (10%) em
14 Após a separação das amostras por SDS-PAGE, estas foram eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose (0,2µM, BioRad, Espanha). De seguida, as membranas foram incubadas durante 5 minutos numa solução de vermelho de Ponceau (0,1%) em ácido acético e lavadas com água Mili-Q. Posteriormente, foram guardadas a 4°C durante a noite. Após o bloqueio da ligação não específica feito durante uma hora, à temperatura ambiente, com uma solução de I-Block 0,5% (Applied Biosystems, EUA) em TTBS (0,02%), as membranas foram incubadas, durante duas horas, com o anticorpo primário monoclonal rato anti-NOS2 (1:200) (Santa Cruz Biotecnhology, Europe). Seguidamente, procedeu-se a 4 lavagens de 15 minutos com TTBS (0,02%). As membranas foram incubadas durante 90 minutos com o anticorpo secundário conjugado com biotina anti-rato (1:10000) (Millipore, Espanha). Após a lavagem do anticorpo secundário, as membranas foram incubadas durante 30 minutos com o anticorpo terciário conjugado com streptavidina (1:10000) (Pierce, EUA). De seguida, procedeu-se à lavagem das membranas com TTBS. Após a lavagem do anticorpo terciário, as membranas foram incubadas com reagente de quimioluminescência (Immobilon western, Millipore, Espanha) para a deteção da proteína de interesse. A intensidade do sinal foi detetada no Chemidoc Molecular Imager (Chemidoc BioRad, Espanha). Por último, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário monoclonal rato anti-β-actina (1:1000) (Sigma-Aldrich, EUA), para posterior normalização. Depois de 4 lavagens de 15 minutos com TTBS (0,02%), as membranas foram incubadas durante 90 minutos com o anticorpo secundário conjugado à biotina anti-rato (1:10000) (Millipore, Espanha). Após a lavagem do anticorpo secundário, as membranas foram incubadas com o anticorpo terciário conjugado com streptavidina (1:10000) (Pierce, EUA), como descrito previamente. Esta incubação para a β-atina permitiu comparar e normalizar a expressão das proteínas em relação à proteína de referência, a β-atina. A intensidade média das amostras controlo em cada membrana foi utilizada como referência para controlar as variações inter gel.