3.1 - Materiais Biológicos - Considerações Gerais Sobre as Espécies em Estudo
3.1.1 - O Hospedeiro – Piaractus mesopotamicus
A espécie Piaractus mesopotamicus (Figura 3), vulgarmente conhecida como pacu, tem a seguinte classificação sistemática:
Classe: Actinopterygii Ordem: Characiformes Família: Characidae Subfamília: Serrasalminae Gênero: Piaractus Espécie: P. mesopotamicus
Figura 3 – Exemplar de pacu, Piaractus mesopotamicus.
É uma espécie de clima subtropical e pode ser encontrada nos ambientes dulceaquícolas (demersal) da Bacia dos rios Paraguai-Paraná na América do Sul. Apresenta uma coloração cinza escuro prateada dorsal e lateralmente e branca ventralmente, com peito amarelado. Habita as florestas inundadas, onde se alimentam
de frutos, nozes e sementes que caem das árvores. Os maiores exemplares da espécie podem atingir o tamanho máximo de 80 cm e o peso máximo de 30 kg.
Entre as espécies de peixes tropicais cultivadas no Brasil, o pacu apresenta um grande potencial comercial devido ao seu fácil manuseio, alta taxa de crescimento e boa aceitação por parte dos consumidores (Jomori et al., 2005). Além do Brasil, o pacu também é cultivado em outros países da América do Sul como Paraguai, Argentina e Uruguai. No Brasil, a produção de juvenis desta espécie atingiu cerca de 9 milhões de indivíduos por ano e juntamente com tambaqui (Colossoma macropomum) a produção chegou a 14.821 toneladas em 2001 (Castagnolli, 1995; Borghetti et al., 2003).
3.1.2- O Parasito – Dolops carvalhoi
A espécie Dolops carvalhoi (Figura 4), vulgarmente conhecida como “carrapato ou piolho de peixe”, tem a seguinte classificação sistemática:
Phylum: Arthropoda Subphylum: Crustacea Classe: Maxillopoda Subclasse: Branchiura Ordem: Arguloidea Família: Argulidae Gênero: Dolops Espécie: D. carvalhoi
Espécimens de Dolops carvalhoi são encontrados parasitando várias espécies de peixes silvestres e cultivados no Brasil. Trata-se de ecotoparasitos que se aderem exclusivamente à superfície exterior de seus hospedeiros, onde causam lesões através da perfuração do tegumento para se alimentarem de células epiteliais e sangue (Malta & Varella, 1983). Pertencem ao chamado grupo dos argulídeos (Branchiura, Crustacea), responsáveis, quando em grandes concentrações, por prejuízos significativos nos animais parasitados. Podem ser caracterizados pela presença de uma carapaça ovoidal, que recobre o corpo achatado dorso-ventralmente. O tamanho varia de alguns milímetros até vários centímetros e são facilmente visíveis na superfície dos hospedeiros, pois além de serem relativamente grandes se movimentam intensamente (Pavanelli et al., 1998).
Figura 4 – Exemplar adulto do “piolho de peixe” Dolops carvalhoi (Lemos de Castro, 1949).
O ciclo de vida de D. carvalhoi é direto, sendo os ovos depositados em substratos, dos quais, após 10 a 50 dias, surgem os jovens crustáceos já com forma semelhante à dos adultos e capazes de sobreviver fora dos hospedeiros por vários dias (Noga, 1996). No Brasil, sua reprodução ocorre entre abril e setembro, dependendo das condições ambientais, embora existam relatos de que este parasito se desenvolva durante o ano todo, de acordo com a temperatura da água. Seu aparecimento parece estar relacionado a excesso de matéria orgânica no ambiente (Kabata, 1988).
3.2 – Cultivo, Aspectos da Biologia e Patogênese de Dolops carvalhoi a partir de Observações em Laboratório
Espécimens adultos de D. Carvalhoi foram coletados em estações de piscicultura da região de São Carlos e trazidos ao Laboratório de Morfologia Funcional, Departamento de Ciências Fisiológicas, UFSCar, para o estabelecimento de uma cultura. Os parasitos foram transferidos e mantidos em aquários de vidro de 200 L, juntamente com cerca de 10 espécimens de pacu em uma sala experimental. A água dos aquários foi constantemente aerada e parcialmente renovada a cada 2 dias. O fotoperíodo foi de 12L:12D e a temperatura da água mantida em 25 ± 2°C.
Assim que os parasitos foram transferidos para os aquários, notou-se a rápida adesão dos mesmos ao tegumento dos hospedeiros e após poucos dias foram observadas oviposições sobre as paredes e substratos estrategicamente mantidos nos aquários. Após
eclosão dos ovos os jovens parasitos prontamente se fixavam aos hospedeiros e assim, reiniciavam um novo ciclo.
Substratos contendo ovos recém-ovipostos de D. carvalhoi foram coletados dos aquários de cultivo e incubados em recipientes com aeração constante e temperatura da água a 25 e 29°C. O tempo de incubação foi de 27 dias para a temperatura de 25°C e 17 dias para 29°C. Estes resultados mostram que o ciclo de vida de D. carvalhoi é, portanto, dependente da temperatura. A taxa média de eclosão dos ovos em ambas as temperaturas foi de 90% (Figura 5).
Figura 5 – Oviposturas de D. carvalhoi vistas ao estereomicroscópio. (A) 15 dias após a deposição dos ovos a 29°C. (B) Ovipostura em eclosão. Escala: A = 10x; B = 20x. Fotos: Imyra M. M. Souza.
A morfologia externa dos parasitos imediatamente após a eclosão dos ovos é bastante similar à dos adultos. São apenas muito menores comparativamente aos adultos e um estádio naupliar, comum neste grupo de parasitos, é ausente. Para fins didáticos, os parasitos foram classificados em três estádios, de acordo com o comprimento do tórax: I (1-3 mm), II (3-5 mm) e III (5-7 mm). Uma das estruturas que mais se destaca na morfologia externa de D. carvalhoi consiste em um par de apêndices anteriores modificados em ganchos e dispostos ao lado da boca. Estes ganchos são articulados, pontiagudos e muito provavelmente representam importantes adaptações para a fixação dos parasitos ao hospedeiro e como componentes do aparelho bucal, auxiliando nos processos de alimentação (Figura 6). Este aspecto da morfologia do parasito está diretamente ligado à sua patogênese, uma vez que tais estruturas podem potencialmente causar sérias lesões no tegumento dos hospedeiros. Os apêndices torácicos posteriores de D. carvalhoi, por outro lado, apresentam outro tipo de adaptação. São birremes e
dotados de várias cerdas que, muito provavelmente, auxiliam os parasitos a se locomoverem e nadarem livremente através da coluna d’água (Figura 7). Durante o processo de desenvolvimento de D. carvalhoi, observaram-se apenas algumas alterações na morfologia externa, como marcado desenvolvimento do tórax e dos órgãos reprodutivos e uma maior pigmentação do corpo. Os sexos puderam ser distinguidos pela observação direta das gônadas situadas no abdome, através da transparência do exoesqueleto dos animais.
Figura 6 – Micrografia eletrônica de varredura da região ventral de Dolops carvalhoi, mostrando a região anterior onde se encontra o aparelho bucal. (A) Boca e ganchos (setas) utilizados na fixação ao hospedeiro. (B) Detalhe do gancho pontiagudo; notar as articulações.
A área de preferência de D. carvalhoi em seus hospedeiros, quando estes se encontram em baixo número, consiste na região imediata à abertura opercular. Algumas hipóteses poderiam explicar esta preferência, como a ausência de escamas nesta região ou ainda o fato de que o constante fluxo de água que passa pelas brânquias beneficiaria as próprias trocas gasosas que ocorrem por difusão através da superfície corporal do parasito. No entanto, quando o número de parasitos atinge um valor muito alto nos aquário de cultivo, eles então se distribuem pelo dorso, flanco, ou ainda por toda a superfície corporal do hospedeiro, incluindo nadadeiras e olhos. O estádio adulto, no qual os parasitos atingem o seu tamanho máximo, constitui-se no mais prejudicial aos hospedeiros. Nesta ocasião e somado a níveis altos de parasitos nos aquários, vários pontos hemorrágicos sob a superfície dos hospedeiros são macroscopicamente visíveis (Figura 8). O fato de que D. carvalhoi se locomove constantemente agrava ainda mais o
A B
quadro patológico, uma vez que os pontos de lesões se multiplicam. A este quadro somam-se mudanças de coloração do tegumento e instalação de infecções por fungos e bactérias, o que leva invariavelmente à morte dos hospedeiros.
Figura 7 - Micrografia eletrônica de varredura da região ventral de Dolops carvalhoi, mostrando os apêndices torácicos posteriores birremes e dotados de cerdas que auxiliam a natação.
Assim, os traumas no tegumento dos hospedeiros causados pela atividade dos parasitos, que levam a hemorragias, infecções secundárias por outros agentes patogênicos, culminam com a morte dos hospedeiros quando os níveis de infestação são elevados. A taxa de mortalidade dos hospedeiros foi sensivelmente reduzida e o tempo de sobrevivência aumentado quando antifúngicos e antibióticos foram adicionados à água dos aquários de cultivo, o que mais uma vez corrobora com a idéia de que as mortes sejam majoritariamente causadas pela instalação de infecções secundárias. As drogas utilizadas aparentemente não afetaram os parasitos.
Quanto ao comportamento dos hospedeiros frente à infestação, mudanças na atividade normal, como comportamentos de fuga ou letargia, não foram verificados nos estádios iniciais da infestação ou quando os parasitos ainda se encontram jovens. No entanto, estados letárgicos são bastante comuns em peixes altamente infestados por parasitos adultos.
Figura 8 – Exemplar jovem de pacu com alta infestação por Dolops carvalhoi. Notar a presença de vários pontos hemorrágicos sobre a superfície do hospedeiro.
A cópula pode ocorrer sobre ou fora dos hospedeiros (na coluna d’água ou sobre substratos). A fêmea normalmente deixa seus hospedeiros para depositar seus ovos preferencialmente sobre a parede dos aquários, ou em casos bastante esporádicos, sobre o tegumento dos próprios hospedeiros.
O número de parasitos nos aquários foi mantido relativamente alto para garantir a viabilidade do cultivo. Quando em número baixo, as respostas dos hospedeiros parecem interferir no estabelecimento dos parasitos. Assim, em situações de altas infestações, os parasitos parecem “driblar” o sistema de defesa dos hospedeiros e se estabelecem com maior sucesso.
3.3 – Coleta e Manutenção dos Peixes em Laboratório
Para o desenvolvimento dos experimentos e manutenção dos parasitos em laboratório, pacus juvenis com cerca de 6 cm de comprimento foram trazidos da Piscicultura Águas Claras, município de Mococa, SP. Quando da chegada ao laboratório, os animais foram cuidadosamente analisados e a presença de D. carvalhoi
ou outros ectoparasitos não foi constatada. Os animais foram mantidos em tanques de 500L em uma sala experimental no laboratório de Morfologia Funcional (DCF/UFSCar), recebendo um suprimento de água constantemente aerada e renovada. A temperatura foi mantida em torno de 25°C e o fotoperíodo de 12L:12D. Os animais foram diariamente alimentados com ração comercial contendo 40% de proteína. Após um período de aclimatação a estas condições, quando então os animais atingiram cerca de 10 cm de comprimento, os experimentos foram iniciados ou os peixes foram transferidos para os aquários de cultivos dos parasitos, conforme a necessidade.
3.4 - Protocolos Experimentais
3.4.1 - Experimento I: Infestação Experimental de Pacu, Piaractus mesopotamicus, com Dolops carvalhoi – Respostas dos Hospedeiros à Infestação
Protocolo Experimental
Após o período de aclimatação às condições de laboratório, 96 pacus juvenis (peso médio = 50g, comprimento padrão médio = 10 cm) foram transferidos para aquários de vidro de 200L em sala experimental. A água dos aquários foi constantemente aerada e diariamente renovada (cerca de 50% do volume total). A temperatura da água foi mantida em 25 ± 2°C e o fotoperíodo foi o mesmo adotado no período de aclimatação. O experimento foi desenvolvido com réplica, com um número de 12 peixes por aquário.
O experimento teve início uma semana após a transferência aos aquários, quando então quatro grupos de peixes foram infestados com 0 (controle), 36, 72 e 144 parasitos adultos de ambos os sexos, com o objetivo de se atingir os níveis iniciais de infestação de 0, 3, 6 e 12 parasitos por peixe (0, 3, 6 e 12 P/P), respectivamente. O procedimento de infestação consistiu em anestesiar animais infestados com parasitos nos aquários de cultivo e coletar cuidadosamente os parasitos com o auxílio de uma pinça. Os parasitos foram contados e colocados em placas de petri contendo água dos aquários experimentais. As placas de petri contendo os números apropriados de parasitos foram então vertidas nos aquários experimentais. Oito peixes de cada grupo (quatro de um aquário + quatro de sua réplica) foram amostrados em 24 horas, 5 e 10 dias após a infestação inicial (1, 5 e 10 DAI). Os peixes foram rapidamente capturados e
transferidos para uma caixa de água contendo 0,01% de benzocaína para serem anestesiados. Depois de anestesiados, o sangue foi imediatamente coletado por punção da veia caudal, em seringas heparinizadas. Sub-amostras de sangue foram utilizadas para determinação do hematócrito e preparação das extensões sanguíneas. O sangue restante foi centrifugado a 4°C, a 10.000 rpm, durante 5 minutos, para obtenção do plasma. O plasma foi então separado e estocado em alíquotas a -20°C. Após a coleta de sangue, os peixes foram sacrificados por secção da coluna vertebral. Amostras de pele da região superior da cabeça foram coletadas com auxílio de bisturi e imersas em soluções fixadoras de Bouin e de Glutaraldeído (2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,3). Os peixes foram dissecados e os rins e brânquias foram cuidadosamente coletados. Os rins foram reservados para a determinação do índice rim-somático. As brânquias foram cuidadosamente removidas da cavidade orobranquial e lavadas em solução salina 0,9%. Uma das metades direita ou esquerda das brânquias foi aleatoriamente selecionada e os quatros arcos branquiais foram separados. O segundo arco branquial foi fixado em solução Bouin para microscopia de luz e os filamentos dos arcos branquiais restantes foram separados de seus arcos, acomodados em microtubos contendo 1mL de tampão SEI gelado (0,3M de sacarose, 20mM de Na2EDTA, 0,1mM
de imidazol, pH 7,1 em HCl) e imediatamente congelados para posterior análise da atividade específica da enzima Na+/K+-ATPase.
Parâmetros Analisados
Neste experimento foram analisados os seguintes parâmetros: • Sangue Total:
o Hematócrito
o Contagem diferencial de células sanguíneas de defesa (leucócitos e trombócitos) • Índice Rim-somático • Plasma: o Cortisol o Glicose o Íons Na+, K+ e Cl- o Proteínas totais o Osmolalidade
• Tecido Branquial:
o Atividade específica da enzima Na+/K+-ATPase o Número de células cloreto
• Epiderme: o Espessura
o Número total de células mucosas (PAS positivas)
o Número de células mucosas acidofílicas ou Alcian Blue positivas o Proliferação celular (número de células PCNA positivas)
o Número de cromatóforos
o Análise da superfície do epitélio através de microscopia eletrônica de varredura
o Ultraestrutura do epitélio (microscopia eletrônica de transmissão)
Análises Estatísticas
Uma vez que diferenças estatísticas não foram observadas entre aquários duplicados, os resultados foram agrupados e expressos como média ± erro padrão da média, para n = 8 peixes em cada tempo de amostragem de cada tratamento. Os diferentes grupos em cada tempo de amostragem foram comparados entre si através de ANOVA. Teste paramétrico one-way ANOVA com pós teste de Tukey foi aplicado quando as diferenças entre os valores de desvio padrão não foram significativas, de acordo com o teste de Bartlett. Por outro lado, se as diferenças entre os valores de desvio padrão eram significativas, o teste não paramétrico com pós teste de Kruskal- Wallis foi então aplicado.
3.4.2 - Experimento II: Respostas de Piaractus mesopotamicus à Infestação e Re- infestação com Dolops carvalhoi – Influência das Respostas dos Hospedeiros sobre a Instalação dos Parasitos
Protocolo Experimental
Após aclimatação às condições de laboratório, 24 pacus juvenis (peso médio = 57g, comprimento padrão médio = 11,5 cm) foram transferidos e distribuídos em 3 aquários de vidro de 200L em sala experimental (3 grupos, n = 8 peixes cada). Como no
experimento I, a água dos aquários foi constantemente aerada e diariamente renovada (cerca de 50% do volume total). A temperatura da água foi mantida em 25 ± 2°C e o fotoperíodo foi o mesmo adotado no período de aclimatação.
Uma semana após a transferência dos peixes aos aquários, um dos grupos foi infestado com 48 parasitos adultos de ambos os sexos, com o objetivo de se atingir um nível inicial de infestação de 6 parasitos por peixe (6 P/P). O procedimento de infestação foi o mesmo empregado no Experimento I. Seis dias após a infestação inicial, os peixes foram anestesiados em 0,01% de benzocaína e os parasitos foram cuidadosamente removidos com o auxílio de uma pinça. Os peixes foram então recolocados em seu aquário de origem. Após 12 dias de recuperação da infestação, este mesmo grupo (denominado Previamente Infestado ou PI) foi re-infestado com 6 P/P, juntamente com outro grupo infestado pela primeira vez (grupo Infestado ou I), também com 6 P/P. Oito peixes de cada grupo (incluindo o grupo Controle ou C) foram amostrados 5 dias após a infestação inicial (5 DAI). Os peixes foram rapidamente capturados e transferidos para uma caixa de água contendo 0,01% de benzocaína para serem anestesiados. Depois de anestesiados, o sangue foi imediatamente coletado a partir da veia caudal, utilizando-se de seringas heparinizadas. Amostras de sangue foram tomadas para determinação do hematócrito e preparação das extensões sanguíneas. O sangue restante foi centrifugado a 4°C, a 10.000 rpm, durante 5 minutos, para obtenção do plasma. O plasma foi então separado e estocado em alíquotas a -20°C. Após coleta de sangue, os peixes foram sacrificados por secção da coluna vertebral e os parasitos aderidos aos hospedeiros foram contados para determinação da densidade de infestação (número total de parasitos em cada peixe). Amostras de pele da região superior da cabeça foram coletadas com auxílio de bisturi e imersas em soluções fixadoras de Bouin e Glutaraldeído (2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,3). Os peixes foram dissecados e os rins e brânquias foram cuidadosamente coletados. Os rins foram reservados pra determinação do índice rim-somático. As brânquias foram cuidadosamente removidas da cavidade orobranquial e lavadas em solução salina 0,9%. Uma das metades direita ou esquerda das brânquias foi aleatoriamente selecionada e os quatros arcos branquiais foram separados. Os filamentos foram separados de seus arcos branquiais, acomodados em microtubos contendo 1mL de tampão SEI gelado (0,3M de sacarose, 20mM de Na2EDTA, 0,1mM de imidazol, pH 7,1 em HCl) e imediatamente
O mesmo procedimento experimental foi repetido, com a finalidade de se obter uma suspensão de macrófagos residentes do peritônio. Seis animais de cada grupo (C, I e PI; n = 18) foram anestesiados. Após anestesia, injetou-se 1,5mL de PBS gelado com 10 IU/mL de heparina na cavidade peritonial através de uma seringa. A região abdominal dos peixes foi rápida e gentilmente massageada, após o qual, cerca de 0,5mL do liquido foi aspirado através de seringa. O lavado peritonial foi então transferido para microtubos previamente esterilizados e imediatamente colocados em banho de gelo para se evitar a adesão dos macrófagos às paredes dos tubos. O lavado foi centrifugado a 4°C por 5 minutos a 10.000 rpm. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet re-suspendido em 1mL de PBS. A suspensão de células foi mantida a 4°C até a realização da contagem e ensaio de espraiamento de macrófagos.
Parâmetros Analisados
Neste experimento foram determinados os seguintes parâmetros: • Densidade de infestação
• Sangue Total: o Hematócrito
o Contagem diferencial de células sanguíneas de defesa (leucócitos e trombócitos) • Índice Rim-somático • Plasma o Cortisol o Glicose o Íons Na+, K+ e Cl- o Proteínas totais o Osmolalidade • Epiderme o Espessura do tecido
o Número total de células mucosas (PAS positivas)
o Número de células mucosas acidofílicas ou Alcian Blue positivas o Proliferação celular (número de células PCNA positivas)
• Macrófagos Residentes do Peritônio o Número de macrófagos
o Índice de espraimento de macrófagos
Análises Estatísticas
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média, para n = 6 ou 8 animais em cada tratamento. Os três grupos foram comparados entre si através de ANOVA. Teste paramétrico one-way ANOVA com pós teste de Tukey foi aplicado quando as diferenças entre os valores de desvio padrão não foram significativas, de acordo com o teste de Bartlett. Por outro lado, se as diferenças entre os valores de desvio padrão eram significativas, o teste não paramétrico com pós teste de Kruskal- Wallis fora então aplicado.
3.4.3 - Experimento III: Respostas de Piaractus mesopotamicus Cronicamente Infestados por Dolops carvalhoi ao Estresse Agudo de Confinamento
Protocolo de confinamento
Um protocolo de confinamento foi inicialmente desenvolvido com a finalidade de se conhecer as respostas de P. mesopotamicus ao estresse de confinamento para, a seguir, aplicá-lo aos animais parasitados. Para tal, 30 pacus juvenis (peso médio = 60g; comprimento padrão médio = 12 cm) foram transferidos para um tanque de 500L, com aeração, fluxo de água e temperatura constantes (temperatura = 25°C; fotoperíodo = 12L:12D). Um mês após aclimatação, um total de seis peixes por grupo foram amostrados imediatamente ao início do confinamento (grupo T0 ou Controle), após 1 (grupo T1), 3 (grupo T3) e 5 (grupo T5) horas de confinamento; um último grupo foi amostrado 24 horas após ter sido submetido a uma hora de confinamento (grupo T24). O procedimento de confinamento consistiu em capturar rapidamente os animais com o auxílio de um puçá e colocá-los em sacos de pesca, que foram mantidos fechados e imersos no tanque de origem. Cada grupo foi depositado em um saco de pesca individual. Todos os sacos apresentaram as mesmas dimensões e o volume foi estimado para o cálculo da densidade de peixes por saco. Assim, o volume estimado dos sacos foi de 15L e a densidade no confinamento aumentou de 4 para 24g de peixe/L de água. Para
amostragem, os peixes foram anestesiados em benzocaína 0,01% e o sangue foi imediatamente coletado por punção da veia caudal, em seringas heparinizadas. Amostras de sangue foram tomadas para determinação dos parâmetros hematológicos. O sangue restante foi centrifugado a 4°C, a 10.000 RPM, durante 5 minutos, para obtenção do plasma. O plasma foi então separado e estocado em alíquotas a -20°C.