1 – Animais e Infecção
Os procedimentos deste projeto foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto Butantan de São Paulo (Anexo 1).
Para manutenção do ciclo de L. minor, camundongos C57BL/6 foram utilizados como hospedeiros intermediários, e gatos domésticos (Felis domesticus) como hospedeiros definitivos experimentais. A manutenção do ciclo de L. minor nos camundongos e gatos foi realizada no biotério do IPTSP, pelos bolsistas do Laboratório de Imunoquímica-IPTSP/UFG (Lucas Rangel, Mariana Felix de Souza Prudente, Thayssa Dourado). A infecção dos animais e coleta do material para imunoistoquímica (IHQ) foram realizadas no Instituto Butantan de São Paulo, pelas alunas Mariana F.S. Prudente e Lara Priscila Guirão, sob orientação da pesquisadora Profa. Dra. Mônica Spadafora-Ferreira.
1.1 – Obtenção de ovos de L. minor
Felinos foram individualmente alimentados com carcaças de camundongos C57BL/6 infectados, contendo 50 a 100 nódulos encistados no tecido subcutâneo com larvas L3 de L. minor. Os ovos do parasita foram colhidos das fezes dos felinos após 30 dias de inoculação e submetidos ao método de Hoffman e Faust (Oliveira et al. 2002). Estes ovos foram mantidos em tubo de polipropileno contendo solução de formalina a 1%, por 40 dias à temperatura de 25°C. Em seguida, os tubos foram centrifugados 3 vezes em salina tamponada com fosfatos (PBS), retirando-se 3 alíquotas de 1µl para serem examinadas entre lâmina e lamínula com auxilio de microscópio óptico comum (aumento de 100X). A concentração de ovos por ml foi calculada sobre o resultado da média aritmética das contagens. Os ovos foram mantidos em formalina 1%, sendo lavados e ressuspendidos em PBS para a inoculação. Os ovos foram obtidos pelos alunos: Lucas Rangel, Mariana F.S. Prudente, Thayssa Dourado.
1.2 – Infecção experimental
Para análise imunoistoquímica, foram utilizados camundongos isogênicos, machos, das linhagens BALB/c (n=50) e C57BL/6 (n=50), obtidos do Biotério Central do Instituto Butantan. Os camundongos foram inoculados por gavagem com 1000 ± 200 ovos infectantes do parasito por animal. Grupos de 5 animais foram eutanasiados em
câmara de CO2, em diferentes períodos pós-infecção (35, 100, 150 e 250). Igual número
de camundongos não infectados (inoculados com PBS por via oral) foram eutanasiados no mesmo período, servindo como controles. Realizou-se evisceração e coleta do baço desses animais, destinados ao congelamento para reação imunoistoquímica. Estes animais foram inoculados, eutanasiados e seus materiais processados no Biotério do Laboratório de Imunoquímica, no Instituto Butantan de São Paulo, em estante ventilada, com caixa, maravalha, água, bebedouro e ração autoclavadas.
2 – Imunoistoquímica (IIQ)
As reações de IIQs foram padronizadas e efetuadas pela equipe da Dra. Mônica Spadafora-Ferreira do Laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantan - São Paulo com a colaboração da Profa. Dra Mara Carvalhaes, e analisadas no Laboratório de Imunoquímica-IPTSP-UFG, com a colaboração do Prof. Dr. Ruy Lino Júnior do Laboratório de Patologia Experimental-IPTSP-UFG.
Para avaliar o perfil imunofenotípico (IFT) por IIQ de células esplênicas, fragmentos de baço dos diferentes períodos (35, 100, 150 e 250 dias) após a infecção, foram embebidos em meio de inclusão para congelamento de tecidos (OCT, Aotec), imersos em isopentano gelado (Vetec, Brasile) e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e posteriormente, armazenados em freezer -80oC. Os fragmentos foram cortados em criostato e fixados em acetona gelada por 10 minutos, sendo mantidos congelados a -80 oC. Antes de fazer a incubação com os diferentes anticorpos, cada lâmina seguiu dois bloqueios de 15 min. O bloqueio da peroxidase endógena foi feito por tratamento com H2O2 (30 Volumes) a 1/1000 em metanol. Após lavagem com
PBS seguiu-se o bloqueio dos sítios livres com soro normal de cabra. Em seguida, sem lavar as lâminas, retirou-se o excesso de soro e foram adicionados os anticorpos diluídos. Estas reações foram efetuadas no Instituto Butantan pelas alunas Lara Guirão e Mariana F.S. Prudente.
Foram utilizados os seguintes anticorpos de rato para camundongos: anti-F4/80 (clone, A3-1, Serotec, EUA), anti-CD19 (clone 1D3, BD Biosciences), anti-CD4 (clone H129.19, BD Biosciences), e anti-CD8 (clone 53-6.7, BD Biosciences), não marcados. Os anticorpos foram diluídos em PBS contendo 2% de soro fetal bovino (SFB), conforme titulação prévia. Após incubação por 18h (overnight) a 4ºC em câmara úmida, as lâminas foram lavadas com PBS e posteriormente incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de rato biotinilado (BD Biosciences). A seguir, foi adicionado o
complexo ABC-peroxidase (Dako, Dinamarca) por 30 min à t.a. As lâminas foram reveladas com diaminobenzidina-H2O2 (DAB-BD Biosciences) como cromógeno
precipitante e substrato, e contracoradas com hematoxilina de Mayer (Merck, Alemanha) (Figura 4).
Figura 4. Esquema ilustrativo de imunoistoquímica, adaptado de: LAPAC 2011.
3 – Quantificação dos subtipos celulares
Em cada ponto da infecção (35, 100, 150 e 250 DAI), foram coletados baços de cinco camundongos e para cada camundongo fez-se uma lâmina de IIQ (feito pelas alunas Lara Guirão e Mariana F.S. Prudente). Para cada lâmina foram fotografados 30 campos na objetiva de 40X. As imagens dos campos para quantificação foram capturadas por meio de uma câmera (Cyber shot DSC-S85) acoplada ao microscópio e ao computador para digitalização. As fotografias foram efetuadas pela Profa. Mara Carvalhaes e pelas alunas Thayssa Dourado e Leticia de Almeida Leandro.
A análise e quantificação das células foram realizadas no sistema analisador de imagens Image J (NIH/EUA). Foram quantificadas as células marcadas positivamente, nas 30 intersecções da grade em cada um dos 30 campos analisados, e calculada a média acumulada (Teixeira et al. 2005) (Figura 5). Os resultados foram expressos em mediana e desvio médio do número de células marcadas por campo. Foi também determinado o índice de células (IC) marcadas por campo, dividindo-se a média aritmética do número de células marcadas presentes nos animais infectados (Мcel+Inf), pela média aritmética do número de células marcadas encontradas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes DAI [IC = (Мcel+Inf) / (Мcel+Cont)].
Figura 5. Fotografia de um campo de imunoistoquímica representando a quantificação celular nas 30
intersecções da grade. As setas indicam células esplênicas marcadas nas intersecções (aumento de 400X).
No presente trabalho foram selecionados campos de imunoistoquímica representativos dos valores da mediana obtidos na quantificação celular. Esses campos foram classificados de acordo com a quantidade de células marcadas para cada anticorpo (anti-F4/80, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19). Os campos com células esplênicas F4/80+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 4 células; moderada, entre 4-6 células e acentuada, mais que 6 células. Os campos com células esplênicas CD4+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 3 células; moderada, entre 3-5 células e acentuada, mais que 5 células. Os campos com células esplênicas CD8+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 3 células; moderada, entre 3-5 células e acentuada, mais que 5 células. Os campos com células esplênicas CD19+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 6 células; moderada, entre 6-7 células e acentuada, mais que 7 células (Tabela 1).
Tabela 1. Classificação dos campos de imunoistoquímica para os marcadores F4/80, CD4, CD8,
CD19 de acordo com a quantidade de células marcadas. Marcador Quantidade discreta Quantidade moderada Quantidade acentuada
F4/80 < 4 células marcadas 4-6 células marcadas > 6 células marcadas
CD4 < 3 células marcadas 3-5 células marcadas > 5 células marcadas
CD8 < 3 células marcadas 3-5 células marcadas > 5 células marcadas
CD19 < 6 células marcadas 6-7 células marcadas > 7 células marcadas
4– Análise Estatística
A análise estatística das contagens de IIQ foi realizada por meio do programa Prisma 4.0. Todas as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Para análise de uma variável utilizou-se a mediana e desvio médio seguido de teste Mann Whitney (não paramétrico). Para mais de uma variável: ANOVA seguido de teste Tukey. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p < 0,05.
RESULTADOS
A disponibilidade de linhagens isogênicas de camundongos com diferentes background genéticos tem contribuído para o estudo da relação parasita-hospedeiro que é crucial no entendimento da resposta imune aos diversos parasitos. Com o intuito de caracterizar as populações celulares no baço de camundongos BALB/c e C57BL/6 controles e experimentalmente infectados com L. minor, foi realizada a análise IIQ da presença de células positivas para os marcadores F4/80 (marcador de macrófagos), CD19 (marcador de linfócitos B), CD4 (marcador de linfócitos T auxiliares), CD8 (marcador de linfócitos T citolíticos).
1 – Análise imunoistoquímica do baço de camundongos infectados com L. minor
A marcação das células esplênicas nos camundongos BALB/c e C57BL/6 com os anticorpos de rato anti-F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19, seguida de incubação com conjugado anti-rato e mistura substrato-cromógeno, mostrou-se positiva e específica, quando comparada ao controle negativo (CN) efetuado sem adição de anticorpos contra os marcadores. Notar a localização predominante destas células na região da polpa vermelha para o marcador F4/80 e região folicular da polpa branca do baço para os outros marcadores (Figura 6).
Figura 6. Imunoistoquímica do baço de camundongos BALB/c infectados, sem anticorpo de marcação
(CN, controle negativo) e com os anticorpos anti-marcadores celulares F4/80, CD4, CD8 e CD19. As setas apontam para marcação celular localizada na polpa vermelha para o marcador F4/80 e na região folicular da polpa branca do baço para os marcadores CD4, CD8 e CD19; aumento de 100X.
1.1 – Análise quantitativa das células esplênicas F4/80+
Nos animais da linhagem BALB/c não foi observada variação significativa na quantidade de células esplênicas F4/80+. Nos camundongos da linhagem C57BL/6, aos 100 dias após a infecção, as células F4/80+ nos animais infectados apresentaram número reduzido de células marcadas por campo em relação aos controles (Controles: 7,0+1,8; Infectados: 4,0+2,0; p< 0,05) e aos 250 dias apresentaram número aumentado em relação aos controles (Controles: 6,0+1,7; Infectados: 9,0+1,8; p< 0,05). A cinética desta população celular foi parecida nas duas linhagens de camundongos infectados, com queda aos 100 dias de infecção, e posterior aumento, dependente do tempo, que foi mais acentuado nos animais C57BL/6 infectados. Considerando o índice de células esplênicas F4/80+, a linhagem BALB/c apresentou aumento somente aos 100 DAI (IC = 1,2), enquanto nos animais C57BL/6 houve aumento do índice de células F4/80+ aos 250 DAI (IC = 1,3) (Figura 7).
Na figura 8 são visualizados campos de imunoistoquímica de baços marcados com o anticorpo anti-F4/80, representativo da quantificação celular aos 100 DAI. Camundongos BALB/c não infectados apresentaram quantidade discreta de células marcadas (Figura 8A) e camundongos BALB/c infectados apresentaram quantidade moderada dessas células (Figura 8B). Para os animais controles da linhagem C57BL/6 foi observada intensa presença de células F4/80+ (Figura 8C) e nos animais C57BL/6 infectados por L. minor foi moderada a presença das mesmas (Figura 8D).
Figura 7. Determinação por imunoistoquímica de células F4/80+ no baço dos camundongos BALB/c e
C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células F4/80+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção.
Figura 8. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas F4/80+. Camundongo BALB/c não
infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (D); aumento de 400X.
35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Controle Infectado F4/80-BALB/c IC 0,9 1,2 0,9 1,0 Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 F4/80-C57BL/6 * * IC 1, 0 0,9 1,0 1,3 Controle Infectado
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o
1.2 – Análise quantitativa das células esplênicas CD4+
As células esplênicas CD4+ durante o período de 100 DAI, apresentaram-se aumentadas nos camundongos BALB/c infectados em relação aos animais controles (Controles: 2,0+1,5; Infectados: 3,0+1,9; p< 0,05). Na linhagem C57BL/6, foi observado aumento aos 150 DAI nos animais infectados em relação aos seus controles (Controles: 4,0+0,8; Infectados: 5,0+1,4; p< 0,05). Nos animais da linhagem BALB/c infectada a cinética de células CD4+ foi crescente em relação ao tempo; entretanto, os camundongos da linhagem C57BL/6 infectada apresentaram cinética oscilante dessas células. O índice de células CD4+ no baço demonstrou que os camundongos da linhagem C57BL/6 apresentaram aumento aos 150 DAI (IC = 1,4); enquanto nos animais BALB/c houve aumento do índice dessas células marcadas aos 100 (IC = 1,2) e 250 DAI (IC = 1,3) (Figura 9).
Na figura 10 observam-se os campos de imunoistoquímica com células CD4+ referente aos 100 DAI. Nos tecidos esplênicos de camundongos controles da linhagem BALB/c visualizou-se quantidade discreta de células marcadas, já os animais infectados apresentaram quantidade moderada de células CD4+ (Figura 10A, 10B). Nos camundongos da linhagem C57BL/6 observou-se quantidade moderada de células CD4+ nos baços de camundongos não infectados e camundongos infectados (Figura 10C, 10D).
Figura 9. Determinação por imunoistoquímica de células CD4+ no baço dos camundongos BALB/c e
C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD4+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção.
Figura 10. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD4+. Camundongo BALB/c não
infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD4+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade moderada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células CD4+ (D); aumento de 400X.
35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 CD4-BALB/c * IC 0,9 1,2 0,9 1,3 Controle Infectado
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 CD4-C57BL/6 IC 1,0 1,0 1,4 1,0 *
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s/ c a m p o Controle Infectado
1.3 – Análise quantitativa das células esplênicas CD8+
A quantificação das células CD8+ no baço de camundongos BALB/c infectados apresentou, somente aos 100 DAI, valores acima dos controles (Controles: 0,0+1,0; Infectados: 1,0+1,2; p< 0,05). Nos camundongos C57BL/6 as células CD8+ apresentaram-se aumentadas em relação aos controles, aos 35 (Controles: 2,0+1,0; Infectados: 3,0+1,2; p< 0,05) e 150 DAI (Controles: 4,0+1,1; Infectados: 5,0+2,3; p< 0,05). Camundongos BALB/c e C57BL/6 infetados apresentaram cinética semelhante da quantidade de células esplênicas CD8+; no entanto, camundongos da linhagem C57BL/6 mostraram maior quantidade de linfócitos TCD8+ esplênicos dos 35 aos 150 dias de infecção, quando comparado aos BALB/c. Considerando o índice de células CD8+ no baço, os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento do índice de células marcadas aos 35 (IC = 1,1) e 100 DAI (IC = 1,3), enquanto nos animais C57BL/6 houve aumento índice dessas células aos 35 (IC = 1,2), 150 (IC = 1,5) e 250 dias (IC = 1,1) pós-infecção (Figura 11).
Os campos de imunoistoquímica na figura 12 mostram células CD8+ referente aos 35 DAI. Nos camundongos não infectados e infectados da linhagem BALB/c, foi visualizado quantidade discreta de células CD8+ esplênicas (Figura 12A, 12B). Nos tecidos esplênicos de camundongos controles da linhagem C57BL/6 visualizou-se quantidade discreta de células marcadas, já os animais infectados apresentaram quantidade moderada de células CD8+ (Figura 12C, 12D).
Figura 11. Determinação por imunoistoquímica de células CD8+ no baço dos camundongos BALB/c e
C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD8+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção.
Figura 12. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD8+. Camundongo BALB/c não
infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 35 dias após a infecção com quantidade discreta de células CD8+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 35 dias de infecção com quantidade moderada de células CD8+ (D); aumento de 400X.
CD8-BALB/c 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 IC 1,1 1,3 1,0 0,9 * Controle Infectado
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 CD8-C57BL/6 * * IC 1,2 0,9 1,5 1,1 Controle Infectado
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o
1.4 – Análise quantitativa das células esplênicas CD19+
O número de células CD19+ no baço de camundongos BALB/c infectados estava aumentado aos 100 (Infectados: 4,0+2,4; Controles: 5,0+1,8; p< 0,05), 150 (Controles: 5,0+1,5; Infectados: 7,0+2,0; p< 0,05) e 250 DAI (Controles: 4,0+1,9; Infectados: 6,0+2,0; p< 0,05) em relação aos animais controles. Aos 250 DAI na linhagem C57BL/6, o número das células CD19+ estava aumentado em relação aos controles (Controles: 5,0+1,0; Infectados: 9,0+1,8; p< 0,05). A cinética do número de células CD19+ nas duas linhagens de camundongos infetados foi diferente, pois nos animais BALB/c observamos aumento gradativo desta população celular até os 150 DAI e posterior queda, e na linhagem C57BL/6 uma cinética oscilante nos diferentes dias de infecção. Verificou-se aumento do índice de células CD19+ aos 100 (IC = 1,2), 150 (IC = 1,3) e 250 DAI (IC = 1,6) nos camundongos BALB/c e aos 150 (IC = 1,1) e 250 DAI (IC = 1,1) nos camundongos da linhagem C57BL/6 (Figura 13).
Na figura 14 são apresentados campos de imunoistoquímica de baço com células CD19+ aos 150 DAI. Camundongos BALB/c não infectados apresentaram quantidade discreta de células marcadas (Figura 14A) e camundongo BALB/c infectados apresentaram quantidade moderada dessas células (Figura 14B). Observou-se quantidade acentuada de células CD19+ esplênicas nos camundongos não infectados e infectados da linhagem C57BL/6 (Figura 14C, 14D).
Figura 13. Determinação por imunoistoquímica de células CD19+ no baço dos camundongos BALB/c e
C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD19+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção.
Figura 14. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD19+. Camundongo BALB/c não
infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 150 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD19+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 150 dias de infecção com quantidade acentuada de células CD19+ (D); aumento de 400X.
CD19- BALB/c 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 * IC 1,0 1,2 1,3 1,6 * * Controle Infectado
Dias após infecção
N ú me ro d e c é lu la s/ c a m p o CD19- C57BL/6 35 100 150 250 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 * IC 1,0 0,9 1,1 1,1 Controle Infectado
Dias após infecção
N ú m e ro d e c é lu la s /c a m p o
DISCUSSÃO
Em estudo anterior do grupo foi demonstrado que camundongos da linhagem C57BL/6 são mais susceptíveis à infecção por L. minor do que os da linhagem BALB/c, com diferenças histopatológicas importantes (Freitas et al. 2008). Posteriormente foi mostrado que esplenócitos de camundongos imunizados com antígenos de L. minor respondem a estes e produzem IFNg e IL-10 (Spadafora-Ferreira et al. 2010). A caracterização IFT das células presentes no baço por IIQ, mostrou que a infecção por L. minor envolve diferentes populações celulares.
A disposição anatômica das células apresentadoras de antígenos (APCs), células B e células T da polpa branca do baço promove as interações necessárias para o desenvolvimento eficiente de respostas imunes. A MZ do baço recebe parte do fluxo sanguíneo que entra neste órgão e antígenos são liberados para este local por DCs circulantes ou são capturados por macrófagos da zona marginal (MZM) que apresentam alta capacidade fagocítica. Os macrófagos metalófilos marginais (MMM), com menor capacidade fagocítica, estão localizados no lado interno da MZ (Aichele et al. 2003; Nolte et al. 2004; Mebius & Kraal 2005).
MZM foram descritosprimeiramente por sua capacidade de reter e interiorizar haptenos polissacarídicos. São caracterizados pela expressão de CR3 (receptor heterodimérico para os produtos de clivagem do C3) em abundância; enquanto que macrófagos da polpa vermelha são desprovidos de CR3. Receptores scavenger I e II, CD36 e receptor de manose também são expressos nos MZM. MZM e MMM são F4/80-, enquanto que macrófagos da polpa vermelha são F4/80+. Macrófagos da polpa vermelha removem auto-antígenos e fagocitam eritrócitos (Nolte et al. 2004; Mebius & Kraal 2005;Van den Berg & Kraal 2005).
Aos 100 dias pós-infecção, na linhagem C57BL/6 os animais infectados apresentaram número reduzido de células F4/80+ em relação aos controles, enquanto na linhagem BALB/c apesar de não significativo observou-se um aumento destas células nos animais infectados em relação aos controles no mesmo período.
Resultados publicados anteriormente mostraram que aos 90 dias na lagochilascariose experimental, camundongos BALB/c apresentaram lesões pulmonares menos intensas e um menor número de nódulos subcutâneos contendo larvas L3 encistadas em relação à linhagem C57BL/6 (Freitas et al. 2008). Como no presente estudo, camundongos BALB/c, linhagem mais resistente a infecção, apresentaram
aumento de células F4/80+ aos 100 DAI, sugerimos um papel importante dessas células na resistência à infecção por L. minor.
Kurotaki et al. (2010) em estudo com população purificada de macrófagos com fenótipo F4/80(hi)Mac-1(low) residentes da polpa vermelha no baço de camundongos, demonstraram que essas células produzem citocinas imunossupressoras como TGFβ e IL10 e induzem a diferenciação de linfócitos Th0 em Tregs CD4+Foxp3+. Os autores sugerem que esta subpopulação pode atuar na homeostase imune periférica.
As células F4/80+ no baço dos animais BALB/c infectados apresentaram aumento do índice aos 100 DAI e nos animais C57BL/6 aos 250 DAI. O anticorpo monoclonal F4/80 tem sido amplamente utilizado como um marcador para macrófagos de camundongos (Van den Berg & Kraal 2005). A molécula F4/80 é expressa em vários subgrupos de macrófagos, incluindo células de Kupffer do fígado, macrófagos residentes da medula óssea, macrófagos da região cortical do timo, macrófagos da polpa vermelha, macrófagos da região medular de LNs e células da microglia no cérebro. Baixa expressão de F4/80 pode ser encontrada em monócitos, e determinados subconjuntos de macrófagos maduros, incluindo aqueles das áreas de células T dos tecidos linfóides secundários. Células de Langerhans e algumas DCs mielóides CD8-,