Purificação do vírus
O vírus CPSMV foi mecanicamente inoculado em plantas de Vigna unguiculata (L) Walp. para sua multiplicação. A purificação do vírus foi de acordo com o método descrito por LIMA & AMARAL (1985). O extrato obtido foi submetido a uma clarificação com n- butanol a 8% por uma noite a 4 °C, sob leve agitação. Após este período o material foi centrifugado em centrífuga Sorval, Rotor GSA a 10.000 g por 10 min. O precipitado foi descartado e ao sobrenadante adicionado 6% de polietileno glicol (PEG PM 6000) e 4% de NaCl, com o objetivo de precipitar o vírus. Após três etapas de centrifugação diferencial a suspensão viral foi submetido a uma ultracentrifugação de 120.000 g durante 2 horas. A concentração proteica da suspensão viral foi determinada pelo método de (BRADFORD, 1976).
LI
Produção da Quimera
O CPSMV foi covalentemente acoplado com a proteína P28 do capsídio do vírus da artrite encefalite caprina de acordo com a metodologia empregada por McKenzie et al. (1984). Foram incubados 200 µL de P28; 10 µL de glutaraldeído 25% e 200 µL de tampão fosfato 0,1 M, pH 6,8, que permaneceram toda a noite em temperatura ambiente (25 °C) e na ausência de luz. No dia seguinte, a mistura foi aplicada a uma coluna de “biogel dextrana blue” calibre p-100, arquitetada em uma pipeta de 10 mL e equilibrada com tampão PBS (0,01 M fosfato de sódio; 0,1 M NaCl, pH 7,3). A eluição das frações foi realizada com PBS e visualizada por espectrofotômetro a 280nm. Uma amostra de 200 µL de solução de CPSMV contendo 400 JGHSURWHína viral foi diluída em 1 mL de PBS e 200 µL de tampão carbonato 1 M, pH 9,5 e em seguida adicionada à P28 covalentemente ligada ao glutaraldeído. A mistura foi encubada por 24 horas a 4 °C e aplicada em uma coluna de “Sephadex Dextran Blue” G-150, arquitetada em seringa de 5 mL e equilibrada com PBS. A quimera (CPSMV-P28) foi eluida em um só pico.
Eletroforese SDS-PAGE
As proteínas dos capsídios virais do CPSMV e do CAEV e a quimera (CPSMV + P28) foram analisadas em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio(SDS) com o gel de concentração a 4% e o gel de separação a 12%, de acordo com o método descrito por (LAEMMLI, 1970).
Imunização Subcutânea
Três grupos de dez camundongos “swiss” fêmeas com 7 a 8 semanas de idade foram imunizados por via subcutânea, na região dorsal, com 10µg de proteína do vírus CPSMV, 10µg da proteína P28 do CAEV e 10µg da quimera (CPSMV + P28), utilizando o adjuvante de Freund incompleto, respectivamente. Os animais receberam reforços 21 e 35
LII dias após o início da imunização e foram sangrados nos dias 7,14,21, 28,35 e 42 após o início da imunização.
Elisa
Os antissoros específicos para o CPSMV, P28 e Quimera foram submetidos a teste de ELISA indireto (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Para esse ensaio, as placas foram sensibilizadas com cada antígeno (0,5µg/orifício). Os antígenos foram diluídos em tampão de carbonato de sódio 50 mM, pH 9,6, sendo usado 100 µl em cada poço. As placas foram incubadas a uma temperatura de 37°C por 2 h. Em seguida, as placas foram lavadas com PBS (NaCl, KH2PO4, Na2HPO4.12H2O e KCl)/Tween (0,05 %) e bloqueadas por 2 h a uma temperatura de 37 °C com PBS- com leite desnatado (10 mM, pH 7,2). Após a lavagem das placas, foram adicionados os anticorpos diluídos (1:40) em PBS e incubadas a uma temperatura de 37 °C por 2 h. As placas foram novamente lavadas e em cada uma adicionado o conjugado imunoglobulinas anti-mouse ligadas à peroxidase, em uma diluição de 1 : 1.000, por 2 h a uma temperatura de 37 °C. Após lavagem das placas com PBS- Tween, a reação foi desenvolvida pela a adição de orthophenylenediamine (OPD) a uma temperatura de 37 °C.
Western Blotting
Para a realização do teste de western blotting foram utilizadas proteínas do CPSMV, P28 e Quimera. As proteínas foram submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida a 4-12% (SDS-PAGE), como descrito anteriormente e depois transferida para uma membrana de nitrocelulose. Após a incubação, as membranas foram lavadas quatro vezes
LIII por 15 min. com solução tampão PBS, sob leve agitação. As membranas lavadas foram imersas em tampão PBS contendo ou anticorpos específicos para o CPSMV ou anticorpos específicos para P28 ambos numa diluição de 1:500 e incubadas por 2h. Em seguida as membranas foram submetidas a quatro lavagens de 15 minutos em PBS e transferidas para uma placa de petri contendo o 2° anticorpo anti-IgG de camundongo ligado à peroxidase na diluição de 1:5000 por duas horas sob leve agitação em temperatura ambiente. As membranas foram novamente submetidas a quatro lavagens de 15 minutos em PBS e foram colocadas em uma solução reveladora, com substrato para peroxidase, composta de diaminabenzidina (DAB)
RESULTADOS
Após ativação da P28 com glutaraldeído foi realizada uma cromatografia de bio-gel como mostra a FIGURA 1. Somente o primeiro pico (pico I) foi utilizado para a posterior conjugação com o CPSMV. Portanto, o pico I foi misturado ao CPSMV e deixado por uma noite de repouso. Em seguida, a mistura foi submetida a uma cromatografia em coluna de Sephadex G-150 revelando a presença de 2 picos, sendo que as proteínas acopladas covalentemente foram eluídas no primeiro pico, como mostra a FIGURA 2.
O perfil eletroforético em SDS-PAGE de alíquotas do primeiro pico revelou a migração proteíca de uma fração com massa molecular estimadas em 116 kDa (FIGURA 3).
A FIGURA 4 mostra a cinética da síntese de anticorpos policlonais, induzida em FDPXQGRQJRV LPXQL]DGRV FRP J GH SURWHínas da quimera utilizando adjuvante de Freund incompleto. Podem ser observadas as respostas primárias e secundárias específicas dos anticorpos reativos com o CPSMV, com a P28 e com a quimera.
LIV O teste de Western blotting comprova a existência da quimera através de seu reconhecimento por anticorpos específicos para o CPSMV e para a P28 (FIGURA 5)
DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo mostraram que o CPSMV pode funcionar como uma efetiva molécula carreadora. Isto porque foi capaz de formar uma quimera estável com a proteína P28 do CAEV, através de ligações covalentes com o glutaraldeído. Vários estudos têm mostrado que o glutaraldeído, por possuir grupos carbonílicos expostos em suas extremidades pode funcionar como ligante entre duas proteínas com aminoácidos que possuem grupos aminos- NH2 expostos (McKENZIE et al. 1984; HAJIMORAD & FRANKI, 1991; HAMAJINA et al., 1995; CUMMINGS et al. 1991). As seqüências de aminoácidos do CPSMV (CHEN & BRUENING, 1992) e da proteína P28 do CAEV (SALTARELLI et al. 1990) mostra que ambas possuem várias lysinas e argininas, que são aminoácidos que apresentam o grupo NH2 em suas extremidades, facilitando a formação das ligações covalentes com grupo carbonílico do glutaraldeído.
A estabilidade da fração covalentemente ligada (CPSMV+P28) eluída em cromatografia (Figuras 1 e 2) foi mostrada em eletroforese em gel de acrilamida SDS- PAGE onde foi detectada uma molécula protéica de aproximadamente 116 KDa (Linhas 1 e 2 da Figura 3), comprovando a ocorrência da ligação das proteínas, uma vez que o CPSMV apresenta três polipeptídios de pesos do moleculares correspondentes a 44, 21 e 14 KDa (Linha 4 da Figura.3 A) e o peso molecular da P28 é de aproximadamente 57 KDa (Linha – 5 e 10 da Figura-3B). A linha 3 da figura 3 mostra duas bandas protéicas uma de 116 KDa e outra de aproximadamente 55 KDa, correspondente a mistura (P28 + glutaraldeído + CPSMV) antes de purificação em cromatografia.
LV A imunização de camundongos com a quimera (CPSMV+P28), através da via subcutânea, com adjuvante de Freund incompleto mostrou que a mesma induziu uma resposta imunológica humoral com síntese de anticorpos específicos reativos tanto com CPSMV como com a P28, em teste de ELISA (Figura 4). Por outro lado não foi observada nenhuma reação com o grupo controle. No entanto, os títulos mais elevados são observados quando a placa é sensibilizada com a própria quimera.
Isto sugere que o acoplamento covalente da P28 ao CPSMV potencializa a resposta imunológica. Também foi mostrado por meio de Western blotting que os anticorpos específicos para o CPSMV e para a P28, reconheceram especificamente a quimera (Figura-5). Isto prova que a banda protéica de 116 KDa é a quimera formada entre o CPSMV e a P28. O aumento da imunogenicidade da P28 sugere que este procedimento pode ser importante para a possibilitar a produção de uma vacina para o vírus CAEV, assim como desenvolver métodos de diagnósticos efetivos.
A alta imunogenicidade do CPSMV através das vias subcutâneas e oral foi mostrada por FLORINDO (1999) e FLORINDO et al. (2002), sugerindo que o mesmo pode ser usado como vetor de expressão de peptídeos ou como molécula carreadora na produção de vacinas, uma vez que o mesmo induz a produção de IgA e de IgG e não induz a produção de IgE.
Muitas investigações têm mostrado o interesse do uso de proteínas conjugadas para estimular a imunogenicidade de vírus e de bactérias (McKENZIE, 1984). HAJIMORAD & FRANCKI (1991) mostraram que a imunogenicidade de alguns vírus de planta é elevada pela estabilidade de seus capsídeos com formaldeído e glutaraldeído. A imunogenicidade
LVI de algumas proteínas podem ser aumentada quando acoplada em uma molécula carreadora (ZHANG et al., 1996 e TRIOZZI et al., 1994).
Concluii-se que a ligação covalente entre o CPSMV e a P28 foi eficaz na formação de ume quimera imunogência , visto que , a mesma foi capaz de imunizar camundongos contra a P28 como mostram os testes de ELISA e Western blot. Sugerindo a possibilidade de uso como antígenos para diagnósticos e vacinas.