3.1 Metodologia de análise enantiosseletiva 3.1.1 Análise cromatográfica
3. 1.1.1 Equipamentos
Foi utilizado o equipamento para cromatografia liquida de alta eficiência da marca Shimadzu (Kyoto, Japão), composto por uma bomba de duplo pistão, modelo LC-10AT-VP, um injetor Rheodyne (Cotati, CA, EUA), modelo 7125 com amostrador de 50 µL, um detector por absorção no UV-Vis, modelo SPD-10A VP, e um integrador modelo CR6-A. Os espectros de dicroísmo circular foram obtidos no equipamento da Jasco, modelo CD-1595 (Tóquio, Japão).
3.1.1.2 Reagentes e solventes
Os solventes utilizados (grau cromatografia) foram etanol (Merck, Darmstadt, Alemanha), hexano (Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, EUA.) e isopropanol (EM Science, Gibbstown, NJ, EUA). Dietilamina (DEA) grau p.a. (Fluka, Buchs, Suiça) foi empregada como aditivo básico.
3.1.1.3 Coluna quiral e coluna de guarda
Para a resolução dos enantiômeros da OXI e DEO foi utilizada uma coluna Chiralpak AD (250 x 4,6 mm, Chiral Technologies, Exton, PA, EUA), constituída pelo derivado de amilose tris (3,5-dimetilfenilcarbamato) recobrindo partículas de sílica de 10 µm de diâmetro. Foi empregada a coluna de guarda NH2 LiChroCart 100 (4 x 4
mm, Merck, Darmstadt, Alemanha), constituída de partículas de 5 µm de diâmetro de sílica modificada com grupos aminonopropil.
3.1.1.4 Soluções-padrão
Os padrões de rac-OXI e rac-DEO foram gentilmente cedidos por Watson Laboratories (Corona, CA, EUA) e Orgamol (Florham Park, NJ, EUA), respectivamente. As soluções de OXI e DEO foram preparadas separadamente, em metanol, na concentração de 1 mg mL-1 do racemato, dissolvendo-se 10 mg do sal em balão volumétrico de 10 mL. Soluções-padrão de OXI nas concentrações de 12,5, 16, 25, 50, 100, 140 e 200 µg mL-1 de cada enantiômero foram obtidas por diluições apropriadas. Foram preparadas, de forma similar, soluções-padrão do metabólito nas concentrações de 10, 13, 20, 40, 100, 140 e 200 µg mL-1 de cada enantiômero. Todas essas soluções foram utilizadas na otimização das condições de separação dos enantiômeros e na validação do método. Na otimização do método de extração empregou-se uma solução-padrão na concentração de 100 µg mL-1 de cada enantiômero. As soluções foram estocadas em fracos âmbares a – 20OC.
3.1.1.5 Condições otimizadas para a análise cromatográfica
Coluna: Chiralpak AD (250 x 4,6 mm, partículas de 10 µm).
Coluna de guarda: NH2 LiChroCart 100 (4 x 4 mm, partículas de 5 µm). Fase móvel: hexano: isopropanol: etanol 95:4:1 (v/v/v) com 0,3% de DEA. Vazão da fase móvel: 0,9 mL min-1.
Comprimento de onda para detecção: 262 nm. Volume de injeção: 50 µL.
Fase móvel para lavagem e estocagem da coluna: hexano: isopropanol 9:1 (v/v) Entre as análises, o injetor e a seringa foram lavados com solução de hexano: isopropanol 9:1 (v/v) para eliminar resíduos dos analitos.
3.1.1.6 Ordem de eluição
Os enantiômeros da OXI e DEO foram separados e coletados conforme as condições cromatográficas descritas em 3.1.1.5, sendo denominados como OXI 1 e 2, DEO 1 e 2. Para se determinar a ordem de eluição, as frações coletadas foram evaporadas a secura, os resíduos foram dissolvidos na fase móvel e em seguida, foram obtidos os espectros de dicroísmo circular (CD) no intervalo de 205 – 450 nm. As frações contendo os enantiômeros isolados também foram analisadas empregando a coluna Chiralpak AD (250 x 4,6 mm, partículas de 10 µm) e hexano: isopropanol (90:10, v/v) + 0,1% de DEA como fase móvel, vazão de 1,0 mL min-1, conforme proposto por Alebic-Kolbah & Zavitsanos (1997).
3.1.2 Preparação das amostras 3.1.2.1 Equipamentos
Para a realização dos experimentos empregando a LPME foram utilizados agitadores magnéticos (Fisatom, São Paulo, SP, Brasil), suporte tipo haste comum e microseringas (50 µL e 250 µL, Hamilton, Reno, NV, EUA).
Para as aferições de pH das soluções aquosas foi empregado o pHmetro Corning, modelo 430 (Nova Iorque, NY, EUA). Um sistema de purificação de água, Milli-Q plus Millipore/Millipore Corporation (Bedford, MA, EUA) forneceu água livre de resíduos orgânicos e inorgânicos para preparação das soluções.
3.1.2.2 Reagentes e solventes
Os reagentes (grau analítico) empregados na preparação das soluções foram fosfato monossódico monohidratado e fosfato dissódico dihidratado (Merck, Darmstadt, Alemanha), hidróxido de sódio e ácido perclórico (Nuclear, São Paulo, SP, Brasil), ácido trifluoracético (Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, EUA) e ácido acético (Chemco, Campinas, SP, Brasil). O solventes grau p.a. impregnados na membrana foram éter n-hexílico (Alfa Aesar, Ward Hill, MA, EUA) e 1-octanol (Sigma, St. Louis, MO, EUA).
As extrações foram feitas empregando-se membrana hidrofóbica de 6 cm de comprimento com um diâmetro interno de 600 µm, espessura de 200 µm e poros de 0,2 µm (Q3/2 Accurel PP, Membrana, Wuppertal, Alemanha).
Cloreto de sódio (Merck, Darmstadt, Alemanha) e metanol (Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, EUA), grau p.a. e cromatografia, respectivamente foram utilizados para a avaliação dos parâmetros que influenciam a recuperação em LPME.
3.1.2.3 Amostras de plasma
Para minimizar o uso de animais, empregou-se plasma humano durante o desenvolvimento e validação do método ao invés de fração microssomal isolada de
fígado de ratos. Visando obter concentração de proteína similar à utilizada em misturas microssomais de incubação, empregaram-se 17 µL de plasma para 1 mL de meio de incubação. Para confirmar a possibilidade de emprego do plasma substituindo a mistura microssomal, ambos foram avaliados nas condições cromatográficas estabelecidas em 3.1.1.5.
As amostras de plasma humano utilizadas durante o desenvolvimento e validação do método foram obtidas no hemocentro do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HC-FMRP-USP) e armazenadas a -20OC até o momento do uso.
3.1.2.4Otimização das condições de extração por LPME
Inicialmente determinou-se o solvente orgânico, tamanho da membrana e fase aceptora que seriam empregados; posteriormente, foram empregados planejamentos experimentais para se obter a condição otimizada do procedimento de extração (Figura 5).
Em função da grande quantidade de variáveis no procedimento de extração, inicialmente foi realizado um Planejamento Fatorial Fracionado com 6 fatores: pH da fase doadora, concentração de ácido da fase aceptora, agitação da amostra, quantidade de metanol e sal na fase doadora e tempo de extração (Tabelas 1 e 2). Este estudo preliminar foi realizado com o objetivo de verificar quais fatores influenciam mais significantemente a extração dos analitos. Para isto foram realizados 8 ensaios em duplicata.
Otimização da Extração
Planejamento Fatorial Fracionado
pH da fase doadora Concentração de ácido na fase aceptora
Agitação Metanol Tempo Sal
Planejamento Composto Central
Os resultados foram avaliados, conforme a equação abaixo, através das diferenças (em módulo) das médias das áreas dos níveis baixos (ensaios com níveis baixos) com as médias das áreas dos níveis altos (ensaios com níveis altos) para cada fator, sendo considerados os valores mais altos como mais significativos.
Fator = Média das áreas do nível baixo – Média das áreas do nível alto
Em função dos resultados obtidos no Planejamento Fatorial Fracionado, foi desenvolvido um novo estudo, através do Planejamento Composto Central (PCC), visando definir qual a melhor condição de extração. O PCC foi delineado
Fator Nível
Baixo Alto
Tempo de extração (min) 20 (A) 40 (a)
Concentração de ácido na fase aceptora (mol L-1) 0,05 (B) 0,2 (b)
Quantidade de metanol (%) 0 (C) 5% (c)
Velocidade da agitação (rpm) 1500 (D) 4500 (d)
NaCl (%) 0 (E) 20% (e)
pH da fase doadora 7 (F) 8 (f) Fator Combinação 1 2 3 4 5 6 7 8 A ou a A A A A a a a a B ou b B b B b B b B b C ou c C C c c c c C C D ou d D d D d d D d D E ou e E e e E E e e E F ou f F f f F f F F F Resultado s t u v w x y z Tabela 2 – Testes realizados no Planejamento Fatorial Fracionado Tabela 1 – Fatores estudados no Planejamento Fatorial Fracionado
empregando-se os 4 fatores: agitação da amostra, quantidade de metanol e sal na fase doadora e tempo de extração (Tabelas 3 e 4).
Níveis Tempo*
(X1) % Metanol (X2) Agitação** (X3) % NaCl (X4)
-αααα 14,5 1,87 1500 2,25 -1 20 2,98 2000 5,00 0 30 5,00 3000 10,00 1 40 7,02 4000 15,00 α αα α 45,5 8,13 4500 17,75 Experimento X1 X2 X3 X4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 -α α 0 0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0 -α α 0 0 0 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 -α α 0 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -α Tabela 4 – Ensaios realizados no Planejamento Composto Central
Tabela 3 – Níveis avaliados para cada fator estudado no Planejamento Composto Central
* Expresso em minutos
Para reduzir os cálculos nos ensaios do planejamento experimental, foi considerada como área da OXI e DEO a soma das áreas dos enantiômeros 1 e 2.
Para avaliação dos resultados do PCC foi empregado o módulo "General Linear Model" do software "Statistica 99 Edition - Kernel release 5.5" da Statsoft, Inc, Tulsa, OK, USA.
3.1.3 Validação do método
3.1.3.1Curva analítica e linearidade
Para obtenção da curva analítica, alíquotas de 25 L das soluções-padrão racêmicas de OXI e DEO foram transferidas, em duplicata, para frascos de 4 mL . O metanol foi eliminado por evaporação sob fluxo de ar comprimido e, em seguida, adicionou-se o plasma e tampão fosfato 1 mol L-1 pH 7,4 até volume de 1 mL (mistura denominada meio de incubação, similar ao meio empregado nas incubações com a fração microssomal). As concentrações dos enantiômeros da OXI e da DEO no meio de incubação foram 312, 625, 1250, 2500, 5000 e 250, 500, 1000, 2500, 5000 ng mL-1, respectivamente. As amostras foram extraídas e analisadas.
Foram construídas curvas analíticas relacionando as concentrações dos enantiômeros versus as alturas dos picos, sendo que as concentrações dos enantiômeros nas amostras foram determinadas através da regressão linear.
3.1.3.2Recuperação
Para avaliar a eficiência da extração, foram analisadas inicialmente (em triplicata) 3 concentrações de amostras não submetidas a extração. Para tanto foram empregadas alíquotas de 25 L das soluções-padrão de OXI nas concentrações de 16, 50 e 140 g mL-1 de cada enantiômero, o que corresponde a concentrações de 400, 1250 e 3500 ng mL-1 de meio de incubação e de DEO nas concentrações de 13, 40 e 140 g mL-1 de cada enantiômero, o que corresponde a concentrações de 325, 1000 e 3500 ng mL-1 de meio de incubação. Estas soluções foram transferidas para tubos cônicos, o solvente foi evaporado até a secura sob fluxo de ar comprimido, os resíduos foram dissolvidos na fase móvel e analisados. Em seguida, alíquotas do meio de incubação fortificadas com concentrações idênticas às anteriores foram analisadas após terem sido submetidas ao processo de extração. A recuperação foi calculada usando a relação das alturas das amostras extraídas e não extraídas (ANVISA, 2003):
Foram calculados as estimativas dos desvios padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV) para cada concentração.
Recuperação (%) = Altura dos picos na amostra submetida à extração
3.1.3.3Precisão e exatidão
A precisão e a exatidão do método foram avaliadas através de estudos intra e interensaios. As amostras foram fortificadas com OXI nas concentrações de 400, 1250 e 3500 ng de cada enantiômero por mL de meio de incubação; para a DEO, as concentrações foram de 325, 1000 e 3500 ng mL-1 de cada enantiômero.
Para os estudos de precisão e exatidão intra-ensaio, cinco alíquotas de cada concentração foram analisadas no mesmo dia. Para os estudos da precisão e exatidão interensaios, foram consideradas 3 concentrações diferentes, em quintuplicata, em 3 dias diferentes. A concentração dos analitos nas amostras foram determinadas a partir de curvas da OXI e DEO preparadas diariamente nas mesmas condições descritas em 3.1.3.1.
A precisão é expressa como estimativa do desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a equação (ANVISA, 2003):
DP
DP é a estimativa do desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.
CV = x 100
A exatidão é expressa em porcentagem do erro relativo, através da equação (QUATTROCCHI; ANDRIZZI; LABA, 1992):
Valor obtido – Valor nominal
3.1.3.4 Limite de quantificação
O limite de quantificação foi avaliado apenas para os enantiômeros da DEO, visto que eram esperadas altas concentrações da OXI nos estudos de biotransformação.
Para avaliação dos limites de quantificação, 5 amostras do meio de incubação fortificadas com 250 ng mL-1 de cada enantiômero da DEO foram submetidas ao processo de extração e analisadas. As concentrações dos analitos nas amostras foram determinadas a partir da curva analítica da DEO preparada nas mesmas condições descritas em 3.1.3.1.
3.1.3.5 Estabilidade durante ciclo de congelamento
O estudo de estabilidade da OXI e DEO foi avaliado realizando-se 3 ciclos de congelamento e descongelamento, empregando-se 3 amostras na concentração baixa (16 e 13 g mL-1, de cada enantiômero da OXI e DEO, respectivamente) e 3 amostras na concentração alta (140 g mL-1, de cada enantiômero).
Neste estudo, as amostras foram congeladas a –20OC por 24 horas e então submetidas ao descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as amostras foram novamente congeladas a –20OC, por 12 horas, e
Exatidão (% de erro) = x 100
assim, sucessivamente, até completar os três ciclos, quantificando-se a OXI e DEO nas amostras após o terceiro ciclo. Os valores de altura dos picos foram comparados com valores obtidos de amostras frescas e a análise estatística foi realizada utilizando o Teste t student (programa Origin 5.0) considerando p 0,05 sendo estatisticamente significante.
3.1.3.6 Estabilidade no tempo de análise
Para este estudo também foram empregadas 3 amostras das concentrações baixa e alta, as quais foram submetidas ao descongelamento natural, a temperatura ambiente e mantidas durante 12 horas sobre a bancada de trabalho. Após este tempo, as amostras foram quantificadas e novamente os valores foram comparados com valores obtidos de amostras frescas; a análise estatística foi realizada utilizando o Teste t student (Origin 5.0) considerando p 0,05 sendo estatisticamente significante.
3.2 Estudo de biotransformação 3.2.1 Equipamentos
Um homogeneizador do tipo “Potter”, modelo MA 181 (Marconi, São Paulo, SP, Brasil) foi empregado para a homogeneização dos fígados dos animais. Para as centrifugações empregou-se centrífuga modelo HIMAC CF 15D2 (Hitachi, Tóquio, Japão) e ultra-centrífuga Beckman, modelo XL-70 (Fullerton, CA, EUA). A quantificação das proteínas nas amostras foi realizada em um espectrofotômetro SPECTRONIC 20 GENESYSTM (Spectronic instruments, Nova Iorque, NY, EUA). As
incubações foram realizadas em banho-maria com agitação, modelo MA093 (Marconi, São Paulo, SP, Brasil).
3.2.2 Reagentes e solventes
O Hepes empregado na preparação de tampão foi obtido da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). As substâncias β-Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo fosfato (NADP), glicose-6-fosfato e glicose-6-fosfato desidrogenase foram obtidas da Sigma (St. Louis, MO, EUA). Foi empregado cloreto de potássio da Nuclear (São Paulo, SP, Brasil), ácido clorídrico da Chemco (Campinas, SP, Brasil), glicerol e tris (base) (hidroximetil)aminometano da J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, EUA) e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) da Carlo Erba (Milão, Itália). Para a determinação de proteínas totais na fração microssomal e no plasma foi utilizado KIT Gold Analisa (Belo Horizonte, MG, Brasil) contendo padrão de soro-albumina bovina e solução de biureto.
3.2.3 Animais
Os animais (ratos Wistar machos, pesando de 180 a 200 g) foram obtidos do Biotério II da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, classificação SPF (Specific Patogen Free). Segue anexada uma cópia do documento de aprovação no Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA).
3.2.4 Aplicação do método
3.2.4.1 Isolamento da fração microssomal do fígado de ratos
Os animais, ambientados a 25ºC com ciclos de luz de 12 horas foram submetidos a jejum na noite anterior aos experimentos. O fígado foi retirado (após decaptação), picado em pequenos pedaços e lavado com solução tampão tris-HCl 50 mmol L-1/ KCl 0,154 mol L-1 pH 7,4. Em seguida, o fígado foi adicionado de aproximadamente 20 mL de tampão tris-HCl 50 mmol L-1/ KCl 0,154 mol L-1 pH 7,4 e triturado em homogeneizador tipo “Potter” em 3 ciclos, sendo que cada ciclo compreende 3 triturações de um minuto com velocidade de 1000 rpm. Posteriormente, houve o isolamento da fração microssomal de acordo com o procedimento representado na Figura 6 (LAKE, 1987).
3.2.4.1.1 Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas na fração microssomal e no plasma foi determinada segundo o método de determinação de proteínas totais e o procedimento está representado na Tabela 5.
Figura 6 – Procedimento de isolamento da fração microssomal a partir do homogeneizado de fígado
Homogeneizado de fígado em solução tampão tris-HCl 50 mmol L-1 / KCl 0,154 mol L-1 pH 7,4.
Centrifugação a 9.000 g/ 15 min/ 4ºC Resíduo Desprezado Sobrenadante Ultra-centrifugação a 100.000 g/ 60 min/ 4ºC Sobrenadante Desprezado “Pellets” Homogeneização com tampão Hepes-HCl 10 mmol L-1 KCl 0,154 mol L-1 EDTA 1 mmol L-1 20%
Diluição/ Dosagem de proteínas/ Congelamento a –70ºC
a Soro-albumina bovina
b Sulfato de cobre pentahidratado 0,15% e tartarato de sódio e potássio 0,6% em hidróxido de sódio
0,75 mol L-1
Após o preparo, as amostras foram homogeneizadas e deixadas por 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro UV-Vis, no comprimento de onda de 545 nm. A concentração de proteínas foi calculada segundo as equações:
Fc =
Onde Fc é o Fator de correção, Cp concentração de proteínas do padrão, Ap absorbância do padrão, Ct concentração de proteínas do teste e At absorbância do teste.
3.2.4.2 Procedimento de incubação
Para a incubação foram utilizados tubos âmbar com tampa. Inicialmente a solução da OXI era adicionada aos tubos e o metanol era evaporado a secura sob fluxo de ar comprimido. Posteriormente, adicionava-se 250 L da solução de incubação (NRS - NADPH regenerating system) contendo NADP, glicose-6-fosfato e glicose-6-fosfato desidrogenase em solução tampão tris-HCl 50 mmol L-1 / KCl 0,154
Branco Teste Padrão
Água destilada 20 L --- ---
Amostra --- 20 L ---
Padrãoa --- --- 20 L
Biuretob 1000 L 1000 L 1000 L
Tabela 5 – Procedimento para dosagem de proteínas
Cp
mol L-1 pH 7,4, resultando em concentrações no meio de incubação de 1,7 mg mL-1, 7,8 mg mL-1 e 1,5 unidades, respectivamente. Finalmente, a fração microssomal do fígado de rato era acrescentada e completava-se o volume do meio de incubação (1 mL) com tampão fosfato 1 mol L-1 pH 7,4. A incubação era realizada sob agitação a 370C. Depois de decorrido o tempo de incubação, a reação era encerrada com a adição de 400 L de ácido perclórico 6% (v/v).
Foram otimizados o tempo de incubação, a concentração de proteínas na fração microssomal e a concentração da rac-OXI empregada. Inicialmente foram empregados 10 L da solução da OXI 1,0 mg mL-1, 68 L da fração microssomal (concentração no meio de incubação de 1,0 mg mL-1) e o tempo de incubação foi variado (5, 10, 15, 30, 45, 60 e 120 min). Posteriormente variou-se a concentração de proteínas da fração microssomal no meio de incubação (0,2, 0,5, 1,0 e 2,0 mg mL-1) e por último a concentração da solução da OXI, sendo empregados 10 L das soluções 0,2, 0,4, 1,0 mg mL-1 e 20 L da solução 1,0 mg mL-1.
3.2.4.3 Determinação das constantes cinéticas
A equação de Michaelis-Menten é a equação de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente com apenas um substrato.
Onde V0 é a velocidadeinicial, Vmax a velocidade máxima, Km a constante de Michaelis-Menten e [S] a concentração do substrato.
V0 =
Vmax[S] Km + [S]
A equação pode ser algebricamente rearranjada em formas que são mais úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais, sendo uma transformação muito empregada a inversão dos dois lados da equação, obtendo-se então gráficos de 1/v por 1/[S] (Lineweaver-Burk) (Figura 7), que permitem a obtenção das constantes cinéticas de Michaelis-Menten (Km e Vmax), de forma mais precisa.
Os cálculos das constantes cinéticas (Km e Vmax) envolvidas na biotransformação da OXI foram obtidos a partir da regressão linear dos gráficos de Lineweaver-Burk. 1/v 1/S M
K
1
−
max V 14 - RESULTADOS E DISCUSSÃO