GESTAÇÃO Caseina17% Caseina17%
2-MATERIAL E MÉTODOS Animais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar da colônia do Biotério do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos com água e ração ad libitum, ciclo claro-escuro 12/12 h (início às 6h). Os procedimentos experimentais obedeceram aos princípios do Comitê de ética desta Universidade.
Grupos Experimentais
Após a verificação de gestação, por observação de espermatozóides no esfregaço vaginal, ratas receberam dieta normoproteica (CS, caseína 17%) ou hipoproteica (DS, caseina 8%) durante toda a gestação. Esses dois grupos receberam tratamento com fluoxetina (10mg/Kg pc, sc) a partir do 14o dia de gestação constituindo os grupos controle fluoxetina na gestação (CFG) ou desnutrido fluoxetina na gestação
(DFG). Após o desmame os animais receberam tratamento agudo com fluoxetina (10mg/Kg pc) constituindo os grupos controle ou desnutrido fluoxetina aguda (CFA, DFA) e controle ou desnutrido fluoxetina gestacional e aguda (CFGA, DFGA). Os grupos experimentais estão descritos na figura 1.
GESTAÇÃO
Caseina17% Caseina17% 14 d Salina 21 d 1 d 35d 14 d Fluoxetina 21 d 1 d 35d 14 d Salina 21 d 1 d 35d 14 d Fluoxetina 21 d 1 d 35d Caseina17% Caseina17% Caseina8% Caseina17% Caseina8% Caseina17% CS CFG DS DFG Caseina17% Caseina17% 14 d Salina 21 d 1 d 35d 14 d Fluoxetina 21 d 1 d 35d 14 d Salina 21 d 1 d 35d 14 d Fluoxetina 21 d 1 d 35d Caseina17% Caseina17% Caseina8% Caseina17% Caseina8% Caseina17% CFA CFGA DFA DFGA Salina Salina (1 ml/Kg pc) Salina Salina Fluoxetina Fluoxetina Fluoxetina Fluoxetina GRUPOSLACTAÇÃO
Figura 1 – Esquema da distribuição dos grupos experimentais. Ratos receberam dieta controle (CS, caseína 17%) ou hipoprotéica (DS, caseína 8%) durante o período de gestação. O tratameto crônico com fluoxetina (CFG, DFG, 1mg/Kg p.c.) foi realizado a partir do 14° ao 21° dia de gestação. Após o desmame, os grupos receberam fluoxetina (CFA, DFA, CFGA, DFGA, 10mg/Kg p.c.) por administração aguda.
Procedimentos
Para a avaliação da SCS, os animais foram mantidos previamente em privação alimentar de cinco horas. Após este periodo, alimento com peso conhecido foi
da gaiola. Foi registrada, durante um periodo de 40 minutos, a duração dos seguintes comportamentos:
Alimentação: O registro desse comportamento foi iniciado imediatamente quando o rato foi observado junto ao comedouro iniciando a ingestão de ração. O mesmo foi finalizado no momento em que o rato abandonou o comedouro.
Limpeza: O rato procedeu inicialmente o lamber de patas anteriores e movimentos dessas sobre a cabeça continuando-se com o lamber da região ventral, do dorso e das patas posteriores.
Repouso: O rato foi observado em posição de descanso, apresentando o corpo respousado sobre o assoalho da gaiola.
Atividade: Incluem outros comportamentos como: locomoção, cheirar, levantar as patas anteriores e explorar a área.
Ingestão alimentar: Foi obtida pela diferença do peso da ração antes e após a observação comportamental.
Análise Estatística
Na comparação dos diferentes grupos, será empregada a ANOVA para os dados paramétricos. Quando a ANOVA revelar diferença significativa, será utilizado o teste de Tukey para identificar as diferenças entre os grupos. Para os dados não paramétricos, será utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Mann- Whitney.
Consumo Alimentar pós-desmame
A avaliação de ingestão alimentar aos 35 dias de vida foi obtida pela subtração do peso da ração antes e após o período de observação comportamental de 40 minutos.
Parâmetros Alimentares
Os parâmetros alimentares associam elementos estruturais importantes na expressão do comportamento alimentar. Assim, relacionam a quantidade de alimento ingerido em cada teste em relação temporal. Foram observados durante quarenta minutos da avaliação da seqüência comportamental de saciedade. Os parâmetros avaliados foram:
AUT- Quantidade de alimento consumida pelo animal por unidade de tempo (g/min). LAT- Tempo (latência) gasto (s) pelo animal para iniciar a ingestão de ração no inicío
do teste.
3-RESULTADOS
Seqüência Comportamental de Saciedade (SCS)
A progressão da alimentação, limpeza e descanso foram analizadas em todos os grupos, sem observação de interrupção da seqüência comportamental. Os animais desnutridos (DS) quando comparados ao CS (controle), mantiveram a estrutura normal da SCS, entretanto, houve aceleração da transição alimentação-descanso mantendo normal o comportamento de limpeza e atividade. A desnutrição aumentou a duração da alimentação e retardou o descanso. O grupo desnutrido fluoxetina na gestação (DFG) quando comparado ao grupo controle fluoxetina na gestação (CFG) manteve a estrutura normal da SCS, entretanto houve aceleração da transição alimentação- descanso, mantendo normal o comportamento de limpeza e atividade. (Figura 2)
A progressão da alimentação, limpeza e descanso foram observadas. O grupo desnutrido fluoxetina aguda (DFA) quando comparado ao grupo controle fluoxetina agudo (CFA) manteve a estrutura normal da SCS, entretanto retardou a transição alimentação-descanso mantendo normal o comportamento de limpeza e da atividade.
CS 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Períodos Du ra çã o ( s) DS 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300
Alimentação Descanso Limpeza Atividade
Períodos D u raçã o ( s) CFG 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Períodos Du ra çã o ( s) DFG 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Períodos Dur aç ão ( s) CFA 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Periodos Du ra çã o ( s) DFA 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Periodos D u raçã o ( s)
Figura 2 - Efeito da desnutrição e do tratamento com fluoxetina sobre a seqüência comportamental de saciedade. Foram avaliados os comportamentos de alimentação, descanso, limpeza e outras atividades no período de 40 minutos. A fluoxetina (1mg/Kg p.c) foi injetada do 14o ao 21o dia
de gestação, e administração aguda aos 35 dias de vida (10 mg/Kg p.c.). Grupos experimentais: CS, CFG e CFA (controle salina, fluoxetina gestacional, fluoxetina aguda), DS, DFG e DFA (Desnutrido salina, fluoxetina gestacional e aguda).
A transição entre a alimentação-descanso foi evidente no período 5.5 (27.5 min da sessão) no grupo Controle (CS), no período 7 (35 minutos da sessão) no grupo desnutrido (DS), no periodo 6 (30 min da sessão) no grupo controle fluoxetina na gestação (CFG) e no período 7.3 (30 minutos da sessão) no grupo desnutrido fluoxetina na gestação (DFG) (Figura 3).
A transição entre a alimentação e descanso foi observada no período 5 (25.0 min da sessão) no grupo CFA e no período 4 (20.0 min da sessão) no DFA. A administração aguda de fluoxetina diminuiu a duração da alimentação e acelerou o descanso no grupo DFA comparado ao CFA (Figura 3).
CS 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 50 100 150 200 250 300 350 Alimentação Descanso Periodos Du ra çã o ( s) DS 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 50 100 150 200 250 300 350 Periodos Dur ação ( s) CFG 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 50 100 150 200 250 300 350 Periodos Du ra çã o ( s) DFG 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Periodos D u ra ção ( s) CFA 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Periodos Du ra çã o ( s) DFA 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 Periodos Du ra çã o ( s)
Figura 3 - Efeito da desnutrição e do tratamento com fluoxetina sobre o período de saciedade em ratos. Foram avaliados os comportamentos de alimentação e descanso evidenciando o ponto de transição entre esses dois comportamentos. A fluoxetina foi injetada (1mg/Kg p.c) do 14° ao 21° dia de gestação, e administração aguda (10mg/Kg p.c.) realizada no 35º dia de vida. Grupos experimentais: CS, CFG e CFA (controle salina, fluoxetina gestacional, fluoxetina aguda), DS, DFG e DFA (desnutrido salina, fluoxetina gestacional e aguda). Duração de 40 minutos os dados
Duração da seqüência comportamental de saciedade durante o tempo total
Os dados gerais da seqüencia comportamental de saciedade estão expressos na Tabela 1. O grupo DS apresentou maior (p<0,05) tempo de alimentação e descanso quando comparado ao CS e DFG. A duração do comportamento de limpeza foi maior (p<0,05) no grupo CS em relação ao DS. O grupo DFG apresentou maior (p<0,05) duração de atividade quando comparado ao DS. Os animais CFA apresentaram a duração do comportamento de alimentação maior p<0,05 que os DFA. O grupo DFA apresentou a duração do comportamento de alimentação maior (p<0,05) que o DFGA. O comportamento de limpeza dos animais CFA foi maior (p<0,05) quando comparados ao DFA e ao CFGA.
Tabela 1 – Dados da seqüência comportamental de saciedade em animais desnutridos e/ou tratados com fluoxetina.
Os dados estão expressos em média ± DP.
* e #
indica diferença entre os grupos.Os dados estão expressos em média±DP. * Indica diferença entre os grupos em relação ao CS e # indica diferença com o DS.
Análises de parâmetros temporais associados à Seqüência Comportamental de Saciedade
Os animais desnutridos salina (DS) apresentaram valores de ATT maiores (p<0,01), e de Latência menores que os animais controles salina (CS) (Tabela 2). Os grupos CFG e DFG apresentaram valores de AUT maiores que os grupos CS e DS respectivamente. A latência para iniciar a ingestão foi menor nos grupos DS, CFG e CFA quando comparados ao grupo CS, e maior nos grupos DFG e DFA quando comparados com o grupo DS (Tabela 2).
Grupos experimentais
Alimentação Limpeza Descanso Atividade CS 1096,0 ± 57,7 156 ± 22,1* 523 ± 98,1 609± 94,2 DS 1652,7 ± 64,1* 69,7 ± 18,8 285,1± 26,2* 426 ± 11,1 CFG 1170,1 ± 108,8 156,7± 23,2 411,3 ± 70,2 605,8 ± 67,8 DFG 1435,1 ± 62,4 91,3 ± 14,4 213,4 ± 31,2 658,2 ± 76,6* CFA 861,0 ± 104,7* 210 ± 31,5# 850,0 ± 138,7 412,0 ± 78,1 DFA 722,3 ± 61,5 # 161,8 ± 22,8 874,3 ± 143,7 566,6 ± 96,6
Tabela 2. Parâmetros da seqüência comportamental de saciedade em ratos
desnutridos e/ou tratados com fluoxetina.
Valores são expressos em media +/- desvio padrão. Student t test. * indica diferença com o grupo CS, # indica diferença com o grupo DS.
Ingestão alimentar de animais desnutridos e tratados com fluoxetina no período gestacional e na vida adulta.
O grupo DS (2,6 ± 0,2) e DFG (2,4 ± 0,3) apresentou aumento (p<0,01) na ingestão alimentar comparados ao grupo CS (1,6 ± 0,2); CFG (1,92 ± 0,4). No grupo DFG (2,4 ± 0,3) houve aumento (p<0,01) da ingestão alimentar em relação ao grupo CFG (1,92 ± 0,4). A ingestão alimentar dos grupos CFA e DFA foram menores que aquelas dos grupos CS e DS respectivamente (CFA 0,73 ± 0,2; DFA 0,93 ± 0,2). Quando comparado ao grupo CFA, o grupo DFA apresentou maior (p<0,05) ingestão alimentar (Figura 4). CS DS CFG DFG 0 1 2 3
*
*
# Grupos Inges tão al im en ta r ( g /g pc) CS CFA DS DFA 0 1 2 3*
*
# Grupos Inges tão al im en ta r (g /g pc)Figura 4 - Efeito da desnutrição e/ou da fluoxetina no período gestacional sobre a ingestão alimentar. Os filhotes de ambos os grupos receberam aos 35 dias de vida solução salina (n= 18, NaCl 0,9%) ou fluoxetina (n=18, 10mg/Kg) 1 hora antes da análise comportamental. Os dados estão representados em média ± DP. * indica diferença com o grupo CS, # indica diferença com os grupos CFG ou CFA.
Grupos Experimentais
Ingestão (g) ATT (g/min) AUT (g/min) LAT (min)
CS 1,6 ± 0,2 8,1±2,1 3,87±0,9 64,6±37 CFA 0,7 ± 0,1 5±1,9 1,81±0,5 30,9±15
*
CFG 1,9±0,4 10,6±3,9*
4,34±1,1 52,9±20*
DS 2,62±0,2 8,7±0,9 6,54±0,4*
0*
DFA 0,93±0,2 7,91±1,9 2,32±0,5 46,6±14,8# DFG 2,4±0,2 11,1±2,4# 5,90±0,7 41,7±21,2#4-DISCUSSÃO
Nesse estudo, investigamos individualmente e simultaneamente as repercussões da desnutrição protéica e do tratamento com inibidor de recaptação da serotonina durante a gestação sobre o comportamento alimentar em ratos. Os dados da análise comportamental revelaram importantes características de variáveis do comportamento alimentar, como duração da refeição e quantidade de alimento ingerido nesses animais.
Esse estudo demonstrou que a desnutrição e a fluoxetina durante o período de gestação promovem mudanças na SCS de ratos, evidenciando-se aumento ou diminuição do disparo da saciedade dependendo do agente agressor. Da mesma forma, esses tratamentos durante a gestação, modularam as respostas do sistema serotoninérgico no controle do comportamento alimentar após o desmame.
Observamos que o tratamento crônico com fluoxetina durante a última semana de gestação promoveu mudanças na sequência comportamental de saciedade após o desmame com antecipação no declínio do período de alimentação e aumento do descanso. Esse contato inicial com a fluoxetina pode ter desenvolvido uma “programação” com anormalidades no controle serotoninérgico sobre o comportamento alimentar (Halford et al 2005). Essa seqüela pode ter sido promovida particularmente porque a manipulação foi realizada durante o período de aparecimento dos primeiros neurônios serotoninérgicos (Lauder e Bloom 1974).
Esse resultado foi semelhante aquele observado em animais que receberam a fluoxetina apenas no período após o desmame neste mesmo estudo. Ou seja, o tratamento com fluoxetina durante a vida fetal promove alterações sobre o disparo da saciedade semelhantes aquela observada com o tratamento agudo na fase pós desmame.Como observado em animais adultos, à fluoxetina promove adiantamento do disparo da saciedade observado por antecipação do declínio da duração de alimentação (David et al, 2003),uma possível explicação para estes nossos achados é que a serotonina inibe a ingestão alimentar antecipando a alimentação devido à interação com os receptores 5-HT1B e 5-HT2C que são os principais receptores serotoninérgicos relacionados ao comportamento alimentar e localizados no hipotálamo (Leibowitz et al, 1990; Halford e Blundell, 1996; Heisler et al, 2002,2006; Dalton et al, 2006).
Um estudo realizado por Guirk (1992) em ratos com administração crônica de fluoxetina demonstrou rompimento do perfil da SCS. Esse autor atribue essa alteração a ação prolongada do fármaco devido à longa vida de seu metabolito a nor-fluoxetina (Guirk et al, 1992). Alguns estudos relatam que a nor-fluoxetina parece afetar a SCS por mecanismos não serotoninérgicos (Simansky e Halford, 1990,1997).
Observamos que a administração crônica de fluoxetina na gestação promoveu aumento da ingestão e da quantidade de alimento por unidade de tempo em animais controle e redução em desnutridos. Essa ação inversa da fluoxetina durante o período gestacional sobre a ingestão alimentar pós-desmame caracteriza as diferentes respostas de organismos desnutridos frente à ação de alguns fármacos.
No nosso estudo a fluoxetina não promoveu ação em animais desnutridos, indicando uma hiporesponsividade desse sistema no controle do comportamento alimentar, o tratamento farmacológico em animais desnutridos parece não exercer a função com a eficiência de um organismo normal, outras evidências mostram que o aumento da atividade serotoninérgica no cérebro destes animais induz a desensibilização da ação anoréxica da serotonina.
Em laboratórios camundongos tratados farmacologicamente apresentaram hiperfagia e um maior tempo no consumo das refeições, sendo um indicativo no déficit da saciedade.Em outros experimentos foi encontrado o aumento do ganho de peso (Teccot et al, 1997).O receptor 5-HT2C desempenha importante função no controle do comportamento alimentar e no tamanho das refeições. O receptor 5-HT1B está relacionado à ingestão alimentar e a saciedade,provavelmente um destes receptores teve alguma alteração funcional, quando submetemos os nossos animais à exposição ao fármaco na gestação que conseqüentemente aumentou a quantidade de alimento por unidade de tempo sendo uma provável explicação para os nossos achados.Observamos em nosso experimento que a desnutrição aumentou a ingestão e retardou o inicio da saciedade, aumentando o tempo de alimentação no tempo total, estudos relatam que animais desnutridos mostraram uma baixa densidade dos receptores na vida adulta (Li et al, 2000) e evidenciou-se que a interação dos neurotransmissores com os seus receptores foram diferentes .
Alguns experimentos indicam que uma dieta hipoprotéica durante o inicío de desenvolvimento altera a ação da serotonina no circuito hipotalámico, que regula a alimentação e sugere que a hiperfagia esta associada à programação metabólica em
ingestão alimentar (Leibowitz et al, 1990; Passos et al, 2007).Outras observações indicam que a desnutrição gestacional afeta alguns componentes no processo da saciedade.
Ninhadas de ratas fêmeas que receberam dieta hipoprotéica no período gestacional apresentaram alterações nos números de neurônios do neuropeptídeo Y (NPY), repercutindo em mudanças no comportamento alimentar (Plagemann et al 2000a;Yura et al, 2005).Outros estudos relataram que os neurotransmissores também foram programados (Plagemann, 2000b; Terroni et al, 2005), e há uma associação entre a desnutrição gestacional e a hiperfagia que provavelmente é decorrente das alterações da ação modulatória da serotonina e a ingestão alimentar (Mokler et al, 2003).
Outro ponto a ser discutido é a concentração utilizada, em estudo anterior do nosso laboratório observamos que o tratamento neonatal com inibidor seletivo de recaptação da serotonina promoveu alterações do crescimento somático e do desenvolvimento sensório motor, mas esses resultados foram inversos quando se administrou baixas doses do mesmo fármaco (Deiró et al., 1998). Em nosso estudo, a dose utilizada durante a gestação foi dez vezes menor que aquela efetiva em promover a saciedade em ratos. Essas respostas alteradas a saciedade podem refletir efeito semelhante no presente experimento,a escolha da menor dose foi devido à associação com outro agente agressor como a desnutrição.
Em conclusão o nosso trabalho mostrou que a desnutrição no período gestacional modulou a resposta inibitória da serotonina e da ingestão alimentar,e que a hipótese da programação fetal indica que a hiperfagia induzida por restrição de nutriente no útero reduz a função regulatória da serotonina na ingestão alimentar.
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