O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 4. Os tratamentos consistiram da inoculação ou não de FMA e da adição de quatro concentrações de Pb ao solo: 0, 250, 500 e 1000 mg kg-1, com sete repetições para cada tratamento.
Preparo do solo
O solo utilizado foi do tipo latossolo vermelho-amarelo de textura argilosa. Foi realizada análise físico-química do solo utilizado no experimento, o qual apresentou pH (CaCl2) de 4,6; 25 g dm-3 de matéria orgânica; 9 mg dm-3 de P e 2, 7 e 29 mmolc dm−3 de K,
Mg e Ca, respectivamente. A amostra de solo foi esterilizada por autoclavagem, a 121oC por 1h, com o fim de eliminar os propágulos infectivos de FMAs, e posteriormente acondicionada em vasos plásticos com dois litros de capacidade. O solo de cada vaso recebeu Pb, sob a forma de solução aquosa de acetato de chumbo, nas concentrações de Pb determinadas para cada tratamento (0, 250, 500 e 1000 mg kg-1). Os nutrientes P e K, que apresentaram concentrações abaixo do adequado foram corrigidos, utilizando-se 10 mL de solução de fosfato de potássio 45 g L-1 em um volume de 2 litros de solo, de acordo com o indicado pelo Boletim 100 (Raij et al, 1996) para culturas anuais. Posteriormente, o solo foi deixado em repouso para estabilização por aproximadamente 15 dias e nova análise de solo foi realizada apresentando-
se os resultados na tabela 1.
Tabela 1 – Características químicas do solo após a adição de Pb e correção da fertilidade.
Pb
(mg kg-1) pH V M.O. P K Ca Mg H+Al B Cu Fe Mn Zn Pb % g dm-3 mg dm-3 mmolc dm-3 mg dm-3
0 5,8 65 15 25 3,0 30 5 20 0,16 3,4 7 11,9 0,9 0,61 250 5,8 60 16 21 2,9 26 5 22 0,18 3,8 9 6,7 0,6 126 500 5,8 63 15 21 2,9 26 5 20 0,17 3,6 8 6,0 0,7 268 1000 5,7 63 17 23 2,8 26 5 20 0,16 3,8 8 9,2 0,7 520
Material biológico
As sementes de Canavalia gladiata, obtidas na área experimental da casa de vegetação do Departamento de Biologia Vegetal do Instituto de Biologia da UNICAMP – Campinas, SP, foram desinfetadas superficialmente com hipoclorito de sódio a 25% por 10 minutos. Os rizóbios específicos para Canavalia ensiformis foram cedidos da coleção do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e para a produção do inóculo foram transferidos para frascos contendo meio liquído YMB (Yeast Manitol Broth) e esses mantidos no escuro, sob agitação constante, durante 6 dias em temperatura ambiente. As sementes foram imersas na suspensão de rizóbios antes da semeadura durante 5 minutos. O inóculo de FMA foi colocado nas covas
das sementes imediatamente antes da semeadura das mesmas. Foram utilizados 10 ml de inóculo misto de FMA, contendo areia-solo, esporos, hifas e raízes colonizadas de Brachiaria
brizantha, que continha aproximadamente 2700 esporos de Glomus etunicatum. Foram
semeadas 4 sementes por vaso e após a emergência foi feito um desbaste deixando-se apenas uma planta por vaso. A seguir, foi realizada uma re-inoculação de suspensão de rizóbio.
Germinação
A germinação das sementes foi acompanhada durante nove dias e considerou-se a emergência do hipocótilo como germinação. A partir dos dados obtidos, foi estimada a porcentagem de germinação. Nesse parâmetro, não foi considerado o tratamento que recebeu inoculação de FMA.
Coleta do material vegetal
Após o período de crescimento de aproximadamente 90 dias, três plantas de cada tratamento foram coletadas, lavadas, subdividas em raízes e parte aérea e secas em estufa a 60°C até atingirem massa constante. As quatro plantas restantes de cada tratamento tiveram a quarta folha trifoliolada completamente expandida coletada, armazenada em saquinhos de papel alumínio e imediatamente congelada em nitrogênio líquido. Posteriormente essas folhas foram armazenadas em freezer a -40°C, onde permaneceram até o momento das análises bioquímicas.
Medidas de crescimento, nodulação e colonização micorrizíca
Foram realizadas as seguintes medidas de crescimento: altura, número de folhas, massa da matéria seca da parte aérea, massa da matéria seca de raízes e massa da matéria seca de
nódulos. Foi contado o número de nódulos para estimar a taxa de nodulação. O clareamento das raízes foi realizado de acordo com o método proposto por Phillips e Hayman (1970) e a colonização micorrízica foi baseada no método proposto por Giovanetti e Mosse (1980) em microscópio óptico com aumento de 400x, observando três lâminas por raiz, com 10 segmentos de raiz de um centímetro cada uma.
Determinações analíticas
Para a extração dos diferentes compostos, aproximadamente 10 mg de tecido foliar liofilizado foi imerso em 3 mL de solução de metanol:clorofórmio:água (MCW) de acordo com Bieleski e Turner (1966) na proporção 12:5:3 (v/v/v), respectivamente. O material permaneceu em geladeira a 4oC, por 4 dias. A esta solução foi acrescentada uma mistura de clorofórmio e água na proporção de 1:1,5 (v/v); esta solução foi agitada e deixada em repouso em geladeira por 24 horas e posteriormente foram coletados 3 mL da fração aquosa- metanólica, que foi seca em concentrador a vácuo (SpeedVac) e ressuspendida em 0,5 mL de água mili-Q para análises bioquímicas. O nitrato foi determinado de acordo com o método descrito por Cataldo et al. (1975), utilizando-se KNO3 para a curva padrão; a amônia foi
determinada de acordo com o método descrito por McCullough (1967), utilizando-se (NH4)2SO4 para a curva padrão; a concentração de aminoácidos solúveis totais foi determinada
de acordo com o método proposto por Cocking e Yemm (1954), utilizando-se leucina para a curva padrão e a peroxidação lipídica foi determinada por meio da quantificação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) Calmak e Horst (1991). As concentrações de P, S, Fe, Zn e Pb em raízes e parte aérea foram determinadas após digestão nítrico-perclórica segundo Abreu et al. (2000) e analisados por ICP-OES (Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectroscopy).
Análise dos dados
Os dados foram submetidos à análise de variância, análise de regressão e teste de Tukey para a comparação de médias utilizando-se o software SISVAR. Os dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x/100)1/2 e os referentes a contagens foram transformados em log (x+1) antes da análise estatística.
RESULTADOS