3.1. Animais e Critério de Amostragem
Este estudo foi submetido ao conselho de ética e experimentação animal da FAPUR/UFRRJ, estando registrado sob o nº 11/2012.
Foram visitados nove haras, localizados nos municípios do Rio de Janeiro (1), de Seropédica (2), de Paracambi (1), de Nova Iguaçu (1), de Vassouras (1) e de Itaguaí (3), com anuência dos proprietários ou responsáveis pelo rebanho.
Foram avaliados cavalos inteiros, castrados e éguas não-gestantes/não-lactantes com idade superior a 18 meses com registro provisório ou definitivo junto à associação da raça. Para exclusão de éguas gestantes/lactantes, foi utilizado registro de controle interno das propriedades. Animais indóceis foram não foram incluídos na amostragem. Após a primeira seleção, foram selecionados ao acaso até 25% de animais do número total de cada propriedade, sendo no máximo avaliados 25 animais em cada. O número total de animais da propriedade e de animais avaliados em cada uma estão descritos no quadro-5.
Quadro 3: Número total de animais e de animais avaliados de cada propriedade
Propriedade Município Total de animais Animais avaliados
1 Seropédica 68 17 2 Itaguaí 40 8 3 Nova Iguaçu 54 11 4 Rio de Janeiro 200 23 5 Paracambi 48 12 6 Seropédica 40 10 7 Itaguaí 24 5 8 Itaguaí 16 4 9 Vassouras 45 10 Total 535 100 3.2. Critérios de Inclusão
Foram incluídos no estudo animais clinicamente sadios. O exame clínico dos animais constituiu-se de resenha, onde os animais foram identificados por nome e em seguida numerados de acordo com a propriedade avaliada na casa das centenas (1 a 9) e por ordem de avaliação na propriedade (01 até o máximo avaliado em cada propriedade). Foi tomado nota do sexo e idade dos animais, de acordo com a ficha de registro na associação da raça. Foi feita breve anamnese, onde a pessoa mais próxima à rotina do cavalo respondeu questões sobre história médica recente e pregressa e fatores sobre o ambiente e manejo do animal avaliado e da propriedade. Foi realizado exame físico levando em conta estado geral do animal e parâmetros vitais. Foi realizado exame de inspeção e palpação para detecção de claudicação (FEITOSA, 2008). Animais que apresentassem febre, feridas abertas, dificuldade respiratória, claudicação ou lesão aparente de qualquer origem ou prenhes ao exame físico foram excluídos da seleção.
Após avaliação clínica, foi realizado hemograma completo em contador automático de células1 e determinação de fibrinogenemia pela diferença dos valores obtidos por
17 refratometria da proteína total em soro fluoretado e após processo de desnaturação a 56ºC por 3 minutos (ECKERSALL, 2008) na triagem, para excluir animais que apresentassem alterações hematológicas.
3.3. Escore de Condição Corporal e Escore de Pescoço
Um único e mesmo avaliador treinado realizou os exames de escore corporal e de pescoço de todos os animais. Os animais foram classificados segundo seu escore corporal (HENNEKE et al., 1983) em uma escala de 1 a 9 e de 0 a 5 de acordo com seu escore de pescoço (CARTER et al., 2009a).
3.4. Porcentagem de Gordura
A mensuração da espessura de tecido adiposo na área da garupa foi feita com o uso de um aparelho de ultrassom, usando transdutor linear, com frequência de5 a 10 MHz. A técnica consiste em obter a imagem no ponto médio da linha imaginária traçada entre as tuberosidades ilíaca e isquiática de um dos lados da garupa (WESTERVELT et al., 1976). Neste caso, foi padronizada a mensuração da camada adiposa, desde a musculatura até a camada interna da pele, sempre do lado esquerdo dos animais.
A porcentagem de gordura corporal foi estimada submetendo os dados obtidos durante a mensuração da camada de tecido adiposo da garupa à equação proposta por Westervelt et al. (1976), onde:
8,64 + (4,70 x espessura do tecido adiposo, em centímetros)
3.5. Amostras sanguíneas
As coletas de dados e de amostras sanguíneas foram realizadas ao longo dos anos de 2014 e 2015.
Foram realizadas coletas de sangue por punção da veia jugular, utilizando-se tubos de coleta à vácuo, para determinação da glicemia e insulinemia de jejum parcial dos animais selecionados. Foram utilizados tubos contendo anticoagulante fluoreto de potássio para determinação de glicemia e anticoagulante heparina sódica para determinação de concentração de insulina plasmática. Os animais foram mantidos em jejum parcial de concentrado por pelo menos 8 horas. Animais que se mostraram indóceis ao momento de coleta de sangue foram retirados do estudo, assim como os demais dados de avaliação clínica, a fim de evitar os efeitos do cortisol sobre a glicemia.
As amostras foram imediatamente acondicionadas em recipiente do tipo cooller contendo água e gelo e prontamente centrifugadas a 2000 g, em intervalo de tempo aproximado de 30 minutos, ainda no local de coleta. Alíquotas do plasma foram acondicionadas em microtubos de 1,5 ml. Após manipulação, as amostras foram reacondicionadas no recipiente do tipo coller contendo gelo e água e transportadas até o Laboratório de Pesquisas Clínicas em Grandes Animais (ClinLab) da UFRRJ, onde foram acondicionadas em freezer -20oC para posterior análise.
3.6. Determinação de Glicemia, Concentração de Insulina Plasmática e Cálculo de Proxies de Sensibilidade à Insulina
18 A determinação da glicemia2 foi realizada no Laboratório de Quimioterapia Experimental em Parasitologia Veterinária (LQEPV) da UFRRJ, em analisador bioquímico automatizado3, utilizando-se kits comercialmente disponíveis, de acordo com as recomendações do fabricante.
As concentrações de insulina foram determinadas em duplicata por meio de radioimunoensaio sanduíche de fase sólida4 (OBA, 2014 – comunicação pessoal, dados não publicados). As análises foram realizadas no laboratório de Biofísica do Departamento de Ciências Fisiológicas da UFRRJ. Foi medida a insulina in natura das amostras. Para a execução do teste, os padrões, controles e amostras foram incubados em tubos revestidos com um primeiro anticorpo monoclonal na presença de um reagente contendo o segundo anticorpo monoclonal radio marcado com I125. Depois de incubado, os tubos foram lavados com a solução de enxágue para retirar anticorpos radio marcados que não se ligaram à insulina. A determinação da radioatividade da ligação foi feita em aparelho gammacounter. As concentrações das amostras foram obtidas através de interpolação com a curva padrão usando programa de dados Graphpad Prism 5.0, sendo os dados obtidos diretamente proporcionais a radioatividade medida.
Os dados obtidos de glicemia e insulina plasmática foram submetidos às equações propostas por Treiber et al. (2005) para se obter os valores de predição da sensibilidade a insulina e da responsividade secretória de insulina das células β pancreáticas a glicose.
Para determinação da sensibilidade a insulina, os dados de insulina plasmática foram utilizados na equação que determina o recíproco quadrado inverso da insulina basal (do inglês: RISQI), onde:
RISQI = 1 = insulina basal-0.5 insulina basal
Para determinação da responsividade secretória de insulina das células β pancreáticas a glicose, os dados de glicemia e insulinemia foram utilizados na equação que determina a razão modificada insulina-glicose (do inglês: MIRG), onde:
MIRG = [800 - 0.30 x (insulina basal -50)2] (glicose basal - 30)
3.7. Análise Estatística
Agrupamento de dados
Após a coleta dos dados de resenha e exame clínico e laboratorial dos animais, os dados referentes a cada animal foram agrupados a fim de analisar aspectos que influenciam o aparecimento da obesidade e flutuações da sensibilidade à insulina. Os dados foram agrupados de acordo com sexo, faixa etária, faixa de escore e sistema de criação
3.7.1.1. Sexo
2 Biosystems®
3A 1 5 ® ( B i o s ys t e ms ® )
19 Os animais foram separados em três categorias distintas de acordo com o sexo, a saber: Fêmeas (éguas não-gestantes/não-lactantes), Garanhões (machos inteiros) e Castrados (machos orquiectomizados).
3.7.1.2. Faixa etária
Características metabólicas de cada faixa etária foram levadas em conta para divisão das classes, levando-se em conta a maturidade óssea e sexual. Os animais foram categorizados em Jovem, Adulto e Idoso. Na categoria Jovem foram incluídos animais com idade de 1 a 4 anos, em Adulto, animais com idade de 5 a 18 anos e em Idoso, animais com idade superior a 18 anos (AMANN et al., 1979, JONES; BERNDTSON, 1986, CARNEVALE et al., 1993, PRICE et al., 1995, PARADIS, 2002, MOREL; NEWCOMBE; SWINDLERHURST, 2005).
3.7.1.3. Categorias de escore corporal
Os animais foram agrupados conforme o estado geral descrito por Henneke et al. (1983) em sua descrição de escore corporal (EC). Foi atribuída a variação 0,5 no EC de forma a denotar transição entre categorias. No grupo Caquético se encontravam animais com EC 1 a 3, em Magro os animais com EC 3,5 a 4, em Ideal animais com EC no intervalo 4,5 a 5,5, em Sobrepeso animais com EC no intervalo 6 a 7 e em Obeso, animais com EC no intervalo 7,5 a 9.
3.7.1.4. Sistema de criação
Foi levado em conta o sistema de criação, sendo Extensivo os animais criados a pasto ou soltos em piquetes, e Intensivo, animais criados em sistema de encocheiramento. Animais do grupo Extensivo tinham dieta baseada em alimentos volumosos e animais do grupo Intensivo recebiam volumoso de diferentes tipos (a saber: capim picado e/ou feno de tifton e/ou feno de alfafa) e alimentos concentrados em energia (rações comerciais).
Procedimentos Estatísticos
Os dados da amostra foram testados para detecção de outliers usando-se o pacote estatístico Reference Value Advisor v. 2.1 (GEFFRÉ et al., 2011).
Dados categóricos (escore corporal, escore de pescoço, quintil de RISQI e quintil de MIRG) foram submetidos à estatística não-paramétrica. Os dados de porcentagem de gordura, glicemia, concentração de insulina, RISQI e MIRG foram testados com o teste de Shapiro Wilk a cada situação avaliada para normalidade. Dados que aceitaram a distribuição gaussiana foram testados por testes paramétricos. Dados com distribuição não-normal foram submetidos a testes não-paramétricos.
Todos os testes utilizados levavam em conta variáveis independentes. Quando dois grupos foram analisados entre si, foi utilizado o teste t como teste paramétricos e o teste de Mann Whitney como teste não-paramétrico. Quando mais de dois grupos foram analisados entre si, foi utilizada ANOVA 1way como teste paramétrico, com subsequente teste de Tukey entre colunas e como método não-paramétrico foi utilizado Kruskal-Wallis, com subsequente teste de Dunn entre colunas. Dados normais foram expressos em média e desvio padrão, dados categóricos e não-normais foram expressos em mediana e amplitude. Foi respeitado o nível de significância a 5% em todos os testes utilizados.
Para a execução dos procedimentos estatísticos, foram utilizados os programas de dados Action Stat v. 3.1.43.702.667 e GrafPad Prism 5.0.
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