O material vegetal utilizado em todos os ensaios experimentais foram sementes de tomate cultivar Santa Clara Miss Brasil (Solanum lycopersicum L.). Os experimentos foram realizados nos municípios de Valença e Vassouras, estado do Rio de Janeiro. A avaliação do efeito da estirpe ENA 4593 de Serratia sp. na promoção do crescimento do tomateiro foi feita através da elaboração de bioensaios laboratoriais.
3.1. ADAPTAÇÃO DE CÂMARA DE CRESCIMENTO
O modelo experimental desenvolvido in vitro neste trabalho baseou-se em ensaios laboratoriais prévios com sementes de tomates no ano de 2011 e 2012.
A avaliação do crescimento de plântulas de tomate em diferentes condições de tratamento foi realizada sob a bancada do laboratório da Universidade Severino Sombra (USS- Vassouras/RJ) (Figura 4).
Figura 4: Sistema de iluminação instalado sob a bancada do Laboratório de Botânica da USS/Vassouras (A) controlado por um Timer Digital da Marca Exatron (B).
Na bancada foi instalado um sistema similar a uma BOD, constituído de 4 conjuntos de lâmpadas fluorescentes com aproximadamente 50 micromol m-2 s-1 de fótons, ligadas a um timer estabelecendo um fotoperíodo de 12 horas, apoiadas sobre dois suportes de madeira de aproximadamente 40 cm de comprimento.
A
Durante os meses de execução do bioensaio em 2012, a temperatura máxima, média e mínima foi aferida com termômetro de máxima e mínima, registrados e plotados conforme os dados descritos na figura 5, sendo que o valor mais elevado de temperatura registrado durante o período experimental foi de 31 °C, e a média das temperaturas máximas foram 26 °C. O menor valor de temperatura mínima foi registrado em 23 °C, sendo a média das temperaturas mínimas de 24 °C, enquanto que os valores de temperatura média variaram entre 23,5 e 28,5 °C, com média de 25°C.
O mesmo procedimento foi repetido ao longo dos anos (2013, 2014 e 2015) de experimentação, e a análise da variação da temperatura possibilitou observar que os valores se mantiveram constante com 25 °C a média, 26 °C a máxima e 24 °C a mínima, apresentando variações de 1 °C para mais ou para menos de acordo com os dias mais quentes e mais frios.
Figura 5: Valores de temperatura máxima, mínima e média registrados durante o período experimental, equivalentes aos dias 19 de novembro até 06 de dezembro, em Vassouras-RJ.
A bactéria endofítica utilizada no presente trabalho foi isolada a partir de sementes de tomate extraídas de frutos produzidos no setor de Horticultura da UFRRJ no ano de 2008 e recebeu o número de registro ENA 4593. Esse microrganismo foi escolhido, por ter se apresentado promissor em ensaios anteriores em condições de laboratório ao longo dos testes de adequação do estresse osmótico utilizando diferentes concentrações de PEG 6000 realizados em 2011.
A fim de avançar nos estudos dos efeitos de BEs sobre a promoção de crescimento de plantas de tomate e mitigação a seca em condições de laboratório foi realizada a caracterização fenotípica e molecular da estirpe ENA 4593, sendo esta estirpe identificada como Serratia sp.
3.2. EFEITO DA INOCULAÇÃO COM ESTIRPE ENA 4593 E DO TRATAMENTO COM PEG6000 EM SEMENTES DE TOMATE CV. SANTA
CLARA (Experimentos I e II)
3.2.1. Preparo do inóculo
Para estudar o efeito da promoção de crescimento da estirpe ENA 4593 de Serratia sp. em plântulas de tomate, primeiro foi feito o ajuste da concentração de inóculo, visando padronizar a suspensão aplicada sobre as sementes. A suspensão foi ajustada para uma concentração de inóculo equivalente a 108 UFC/mL. Esse ajuste foi feito com base nos valores de transmitância obtidos por meio de uma curva de diluição usando para isso diferentes valores de transmitância para um mesmo isolado. A partir desses valores realizaram-se diluições seriadas para obtenção das unidades formadoras de colônias (UFC) referentes a cada valor de transmitância. Os valores de transmitância e o número de UFC foram passados para planilha Excel onde foi construída uma curva e obtido uma equação onde X = valor da transmitância e Y = UFC (Tabela 1).
Tabela 1. Equação obtida a partir da curva de calibração e os respectivos valores do coeficiente de Regressão R2. Valores da transmitância calculada para obtenção de uma suspensão ajustada para 108 UFC -1ml.
Identificação do Isolado Equação Valor de
R2
Transmitância calculada (%)
Testemunha - - 100
Serratia sp. (isolado 11) y = -5E+07x + 5E+09 0,9978 76,3 Serratia sp. (isolado 15) y = -1E+08x + 1E+10 0,8927 76,8 Serratia sp. (isolado 21) y = -9E+09x + 8E+11 0,9067 86,8
X= valor da transmitância e Y= UFC
A suspensão concentrada do isolado foi preparada com um volume de aproximadamente 10 mL. A transmitância dessa suspensão foi aferida em aparelho espectrofotômetro e em seguida anotada o seu valor. Uma alíquota de 100 µL da suspensão
foi retirada e adicionada a um microtubo de 1,5 ml contendo 900 µL de solução salina (diluição 10 -1 da transmitância). O microtubo foi reservado. Para obtenção do segundo valor de transmitância foi adicionado cerca de 6 mL de solução salina ao tubo contendo a suspensão inicial. Novamente foi aferida a transmitância e anotado o seu valor. Esse procedimento foi realizado até a obtenção de pelo menos 5 valores de transmitância. Após a obtenção das transmitâncias, procedeu-se a diluição seriada até 10-7. Três alíquotas de 100 µL foram retiradas de cada diluição e riscadas em três placas. As placas foram acondicionadas em estufa bacteriológica com temperatura regulada para 28º C por 48 horas. As UFC foram anotadas por placas, retiraram-se o valor médio de UFC/ placa e após procedeu-se o cálculo para obtenção de UFC.mL -1.
3.2.2. Desinfestação das sementes
Antes de serem submetidas aos tratamentos, as sementes cv. Santa Clara foram superficialmente desinfestadas com uma solução de álcool a 50% por 30 segundos, hipoclorito de sódio a 0,7% por 3 minutos e sucessivas lavagens de água destilada estéril em agitador vórtex, com cinco trocas de água. Após a desinfestação, as sementes foram peneiradas e colocadas para secar em temperatura ambiente.
3.2.3. Tratamento das sementes A. Inoculação à vácuo
Para avaliar os efeitos da inoculação da bactéria endofítica na fase de germinação do tomateiro, foram realizados experimentos utilizando o isolado ENA 4593 de Serratia sp., obtido da coleção do Laboratório de Patologia e Epidemiologia de Sementes da UFRRJ, Seropédica/RJ.
A manutenção do isolado em condições laboratoriais, foi possível através da utilização de 6 mL de meio de cultura Nutriente Agar (Fahy e Hayward, 1983), disposto de forma inclinada em tubos de ensaio de 15 cm de comprimento. Sobre a superfície sólida do meio de cultura (NA) foi repicada uma alíquota de aproximadamente 0,1 mL do isolado, com auxílio de uma alça bacteriana. Além disso, foi utilizado glicerol estéril a 20 % nos tubos de ensaio contendo o isolado bacteriano repicado, a fim de recobrir toda a superfície do meio de cultura
A determinação da concentração de células bacterianas presentes na suspensão foi feita através da utilização de uma alíquota de suspensão bacteriana, na sua fase de crescimento exponencial, diluída em água destilada estéril e calibradas em espectofotômetro. Para a calibração e leitura da amostra foi utilizado o comprimento de onda de 540 nm, e a concentração padrão obtida na curva de inóculo, de modo que a concentração final fosse de 108 UFC.ml-1 (80% de transmitância) presente na solução.
As sementes previamente desinfestadas foram depositadas em frascos Erlenmeyers estéreis, submetidos a dois tipos de tratamentos. Metade das sementes desinfestadas foram colocadas nos frascos de Erlenmeyer contendo 40 mL de água destilada estéril (sem inóculo) e a outra metade foi depositada em solução de 40 mL de suspensão bacteriana do isolado na concentração de 108 UFC.ml-1 (com inóculo).
Os frascos foram acondicionados a um dessecador acoplado à bomba de vácuo, sendo que o vácuo aplicado foi equivalente a 680 mm de Hg, com liberação lenta do ar, em três ciclos sucessivos, com duração de cinco minutos cada ciclo, intercalados com três minutos de repouso (Figura 6).
Figura 6: Inoculação da estirpe ENA 4593 de Serratia sp. em sementes de tomateiro cv. Santa Clara, com auxílio de um dessecador acoplado à bomba a vácuo no laboratório de Botânica da USS/Vassouras-RJ.
Após a inoculação, as sementes foram peneiradas e colocadas para secar sob ventilação forçada em Câmara de Fluxo Laminar por uma hora.
A viabilidade do inóculo foi observada a partir da deposição de sementes inoculadas em tubos de ensaio contendo meio de cultura NA. Em seguida, os tubos foram acondicionados em estufa bacteriológica regulada para temperatura de 35-37 °C por 48 horas. A colonização do inóculo nas sementes foi comprovada com o crescimento de colônias bacterianas, sobre a superfície do meio de cultura (Figura 7).
Figura 7: Sementes de tomate cv. Santa Clara Miss Brasil colonizadas pela estirpe ENA 4593 de Serratia sp.