O trabalho experimental foi realizado no Laboratório de Processos de Separação (LPS) do Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA), da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa - MG.
3.1. Escolha do sistema de trabalho
O sistema de trabalho foi aquele composto por 18% (p/p) PEG 1500 e 18% (p/p) fosfato de potássio (FFP), o qual apresentou bons resultados na separação de α-la e β-lg, segundo os resultados de ZUÑIGA (2000). A seleção da concentração de isolado protéico de soro de queijo em pó (IPS) para emprego no sistema de trabalho foi feita com base na viscosidade de cada uma das fases.
3.1.1. Preparo dos sistemas de fases
Os sistemas aquosos bifásicos foram preparados a partir de soluções estoques de PEG 1500 (50% p/p) e FFP (30% p/p; pH 7). Para o preparo das soluções-estoque de sal a 30%, foram adicionadas quantidades de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) e dibásico (K2HPO4), na proporção de 1:1,82 para
que fosse atingido o pH 7. O sistema, na concentração desejada 18% (p/p) PEG 1500 + 18% (p/p) FFP, foi formado por exemplo, adicionando-se em um tubo de ensaio 3,6 g da solução-estoque de PEG, 6 g de solução-estoque de FFP (30% p/p, pH 7) e água, até completar 10 g. Em seguida, os tubos foram agitados durante 60 minutos e deixados em repouso, por 12 horas, para a separação das fases. Neste trabalho, foram empregados 500 g de sistema.
O isolado protéico de soro (Davisco Foods, USA) foi dissolvido na fase salina, gerando soluções com concentrações de (5, 10 e 15)% p/p. Em seguida, a solução foi filtrada e misturada com a fase polimérica e agitada, por 2 horas, em um agitador magnético. O sistema foi então transferido para um funil de separação, permanecendo em repouso, por 12 horas, até atingir o estado de equilíbrio. Após este intervalo de tempo, foram utilizadas alíquotas das fases superior e inferior para a avaliação da viscosidade.
3.1.2. Viscosidade
A viscosidade foi determinada em reômetro de esferas descendentes (Rheo Viscosimetro KD 2.1; Haake), a 25 °C, para cada uma das fases do SAB, nas diferentes concentrações de IPS. O reômetro foi primeiramente calibrado com uma solução padrão para fluidos Newtonianos de viscosidade conhecida na temperatura de estudo.
3.1.3. Densidade
As densidades das fases foram determinadas através de um picnômetro de 25 cm3, mantendo-se a temperatura a 250C. O picnômetro foi primeiramente calibrado com água destilada na temperatura de estudo.
3.2. Coeficiente de partição das proteínas
O coeficiente de partição foi determinado após a incorporação de 10% (p/p) de IPS ao SAB de 18% (p/p) PEG 1500 + 18% (p/p) FFP (pH 7).
A solução foi agitada por duas horas, em um agitador magnético. A seguir, foi transferido para um funil de separação, onde permaneceu em repouso por 12 horas, até atingir o estado de equilíbrio. Após este intervalo de tempo, foram utilizadas alíquotas das fases superior e inferior, para a quantificação da concentração das proteínas por cromatografia líquida em fase reversa (HPLC-RP). O coeficiente de partição (K) foi definido como a razão entre a concentração de α- la ou β-lg na fase rica em PEG (CT) e a concentração da mesma proteína na fase
rica em sal (CB), sendo calculado através da eq. (5).
3.3. Determinação das condições operacionais para purificação das proteínas nas fases
A escolha das condições operacionais ótimas da CEM para purificação das proteínas das fases polimérica e salina foi feita com base na resolução da separação dos componentes, e na produtividade do processo de purificação.
3.3.1. Preparo do gel e empacotamento da coluna HR 10/10
O gel Shepadex® G-25 foi hidratado em uma solução de NaCl 0,1 M (fase móvel). Foi usado excesso de volume de fase móvel (50 mL) em um béquer de 100 mL. A mistura foi agitada, esporadicamente e levemente, com bastão de vidro, durante 4 horas, à temperatura ambiente. Então, procedeu-se à remoção das partículas pequenas por elutrição. A desaeração da suspensão gélica foi feita em Ultra-som (Branson) e o gel empacotado na coluna HR 10/10 (10 mm de diâmetro x 100 mm de comprimento, Pharmacia Biotech). O empacotamento foi feito transferindo, de uma única vez, o volume total do gel hidratado. Para tanto, foram utilizados um adaptador de empacotamento HR 10 (Pharmacia Biotech), uma
bomba peristáltica P-1 (Pharmacia Biotech) e a mesma fase móvel usada na hidratação do gel, em uma vazão de 6 mL/min. A coluna empregada no experimento pode ser vista na Figura 3.1.
Os dois tipos de géis testados foram o Shepadex® G-25 superfino e Shepadex® G-25 médio. As faixas de diâmetros de partículas e o LEM foram, respectivamente, de (10 a 40 ) µm e 5.000 Da para o gel superfino, e de (50-150) µm e 5.000 Da para o gel médio.
Figura 3.1 Coluna HR 10/10 empacotada com Shepadex® G-25
3.3.2. Purificação das proteínas presentes nas fases
A purificação das proteínas das fases salina e polimérica foi feita em escala semi-preparativa, em equipamento adequado para o trabalho de cromatografia preparativa (ÄKTA Purifier 10/100, Pharmacia Biotech). Foram testadas diferentes vazões da fase móvel (água deionizada): (0,2, 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 ) mL/min. Os volumes das amostras injetadas foram de (0,3, 0,5, 1,0 e 1,5) mL. A injeção das amostras foi feita em duplicata usando um dispositivo de injeção (“superloop”) de 150 mL. A fase polimérica foi diluída na proporção 2:1 (água : amostra) antes da injeção, devido à alta viscosidade apresentada.
O eluente foi monitorado por absorção de UV a 280 nm. A coluna HR 10/10 (Pharmacia Biotech) suportou a pressão máxima de 1 MPa. As amostras foram coletadas em intervalos regulares de volume, com um coletor de frações (Frac-
900, Pharmacia Biotech). A figura 3.2 apresenta um diagrama esquemático do processo experimental.
Figura 3.2 Esquema básico utilizado no processo de purificação das proteínas das fases (PEREIRA,1999)
3.3.3. Determinação da resolução
A resolução na separação dos componentes foi determinada por absorção de UV a 280 nm, a partir de (FISCHER, 1974):
)
(
)
(
2
2 1 1 2 H H R R sW
W
V
V
R
+
−
×
=
; (VR2 > VR1) (27) em que:VR1: Volume Retenção do pico 1
VR2: Volume Retenção do pico 2 WH1: Largura do pico 1
3.3.4. Determinação da produtividade do processo
A produtividade foi calculada usando a eq. (4) que relaciona a quantidade da proteína (α-la ou β-lg) presente na fase polimérica ou na salina, pelo produto (volume do leito empacotado na coluna x tempo do processo de separação). O tempo de separação foi determinado como o quociente entre a vazão da fase móvel e o volume de amostra injetada. Os gráficos de produtividade foram construídos em função da vazão para cada volume de injeção.
3.4. Análise das frações obtidas na purificação das fases
3.4.1. Análise e quantificação de α-lactoalbumina e β-lactoglobulina
As proteínas α-la e β-lg contidas nas frações coletadas foram quantificadas simultaneamente por CLAE, nas seguintes condições de trabalho (ZUÑIGA,
2000):
-Coluna de fase reversa: CLC ODS-C18 de 250 mm x 4,6 mm (Shimadzu). -Coluna de guarda: CLCG-ODS de 10 mm x 4 mm ( Shimadzu).
-Vazão da fase móvel: 1 mL/min -Temperatura: 400C
-Detector: feixe de diodos (SPD-M10AVP- Shimadzu) -Volume de injeção: 20 µL
-Comprimento de onda: 210 nm
-Fase móvel: (A) acetonitrila, (B) NaCl 0,15 M, pH 2,5
O gradiente foi programado da seguinte forma:
• 100%A, 0%B --- 64%A, 36% B, em 3 minutos; • 64%A, 36%B --- 45%A, 55% B, em 18 minutos; • 45%A, 55%B --- 45%A, 55% B, em 2 minutos e • 45%A, 55%B --- 100%A, 0% B, em 10 minutos.
3.4.2. Elaboração da curva de calibração
As curvas de calibração para a α-la e β-lg foram construídas a partir de soluções das proteínas puras em concentrações na faixa de (0,02 a 3,5) mg/mL. As soluções de proteínas foram preparadas empregando-se a fase móvel A (NaCl 0,15 M, pH 2,5). O pH da solução protéica da fase móvel foi ajustado usando-se uma solução concentrada de HCl.
3.5. Modelagem matemática da CEM
3.5.1. Determinação da porosidade do leito (åb)
A porosidade do leito (åb) depende somente do tamanho das partículas e da
técnica do empacotamento. O valor de åb foi calculado avaliando-se o tempo de
exclusão (td) de uma molécula de azul de dextrana (2.00000 Da) do leito.
O valor de åb foi mantido constante em todas as condições de trabalho da
coluna, sendo usada em seu cálculo a eq. (28) (GERBERDING e BYERS, 1998; ALTENNHÖNER et al., 1997):
L
d
ð
Q
4
t
=
å
b d 2 (28)em que a vazão da fase móvel (Q) foi de 4 mL/min, o comprimento da coluna (L) foi de 10 cm e o diâmetro da coluna (d) foi de 1 cm.
3.5.2. Determinação da porosidade da partícula (åp)
Para obter a porosidade da partícula (åp) é necessário avaliar o tempo de
retenção para que uma molécula seja capaz de penetrar nos poros da partícula do leito. É necessário, também, que a massa molecular desta substância esteja dentro da faixa de operação do gel. No cálculo de εb, foi utilizado o tempo de
retenção (t0 ) de uma molécula de acetona na coluna. A eq. empregada foi (ZHIGUO et al., 1998): b d p t t ε ε ε ) - 1 ( ) 1 ( b 0 − = (29)
3.5.3. Determinação da porosidade acessível da partícula para o soluto (
å
pa)A porosidade acessível da partícula representa a fração de volume acessível do macroporo para um soluto em particular. Este parâmetro foi determinado para cada um dos componentes do sistema: proteínas da fase polimérica, proteínas da fase salina, PEG e FFP, de acordo com a eq. (30) (ZHIGUO et al., 1998). Os tempos de retenção (tR) das moléculas foram obtidos a
partir das vazões usadas na separação de cada uma delas (4 mL/min e 2 mL/min para as fases polimérica e salina, respectivamente).
b p a ε ε ε ) - 1 ( ) t t - 1 ( b R d = (30)
3.5.4 Solução numérica do modelo
O modelo matemático da CEM dado pelas eqs. (20) e (21) juntamente com as respectivas condições iniciais e de contorno, eqs. (22), (23), (24), (25) e (26) foram reduzidos a um sistema de equações algébricas, usando-se o método implícito de diferenças finitas centradas no espaço e um passo à frente no tempo.
Este sistema de eqs. diferenciais e algébricas foi resolvido simultaneamente, utilizando-se o método de Gauss-Seidel (CONCEIÇÃO et al., 1987).
Os valores ótimos dos parâmetros Pe ,