MATERIAL E MÉTODOS 1 Manutenção dos moluscos

As criações matrizes de moluscos foram estabelecidas com espécimes coletados no município de Juiz de Fora, Minas Gerais (21° 45′ 50″ S, 43° 21′ 0″ W) (678 metros de altitude em relação ao nível do mar). Sessenta indivíduos recém nascidos foram mantidos em caixas plásticas transparentes (14 cm de diâmetro, 9 cm de altura), com 30 indivíduos por caixa, em duas réplicas. Os grupos experimentais foram submetidos ao mesmo tratamento. O fundo de cada caixa foi recoberto com terra vegetal, que foi umedecida a intervalos de dois dias, com 10 ml de água de torneira. Os moluscos foram alimentados ad libitum com alimento comercial de aves suplementado com carbonato de cálcio (na proporção 3:1) (BESSA eARAÚJO,1995). Os moluscos foram mantidos

sob temperatura ambiente e condições naturais de luz e temperatura. Este estudo foi conduzido no período de 17 de Setembro de 2004 a 17 de Agosto de 2007, por um total de 142 semanas.

Com o objetivo de verificar o número de eventos reprodutivos (presença de filhotes no terrário) e número de filhotes produzidos por indivíduo, após o alcance da maturidade sexual, cada molusco foi mantido individualmente em caixas plásticas transparentes (10 cm de diâmetro, 6 cm de altura), com as mesmas condições descritas anteriormente.

2.2.2 Crescimento, reprodução e sobrevivência

Para verificar as características da história de vida de L. unilamellata, foi verificado, para os moluscos de cada réplica, a sobrevivência, o aumento médio no comprimento da concha e tempo médio para o alcance da maturidade sexual. Após o alcance da maturidade, foi verificado o número de filhotes produzidos, a longevidade e o crescimento de cada indivíduo. A partir desses dados, foram calculadas a taxa de crescimento (aumento do comprimento da concha por dia) e a fecundidade (número total de filhotes produzidos pelo número total de eventos reprodutivos realizados).

O comprimento da concha de cada indivíduo foi verificado, utilizando-se um paquímetro com 0,1 mm de precisão. Até a idade de 90 dias de vida, os comprimentos das conchas foram medidos a intervalos de 15 dias. Após essa idade, as medidas foram tomadas a intervalos de 30 dias.

A presença de embriões no útero dos moluscos, visualizada através da transparência da concha, indicou o alcance da maturidade sexual. Para o registro da mortalidade, o número de

eventos reprodutivos e o número de jovens produzidos por indivíduo, os moluscos foram observados semanalmente desde o alcance da maturidade até a morte do último indivíduo.

Os dados referentes aos jovens, desde o início do experimento até o alcance da maturidade sexual, representam os valores médios por réplica, enquanto os dados referentes aos adultos representam os valores médios calculados a partir dos dados de cada indivíduo. Para verificar a existência de diferenças no crescimento dos moluscos durante a fase jovem (antes do primeiro evento reprodutivo) e a fase adulta do ciclo de vida, foi utilizado o teste t de Student. Para verificar a existência de correlação entre o número de eventos reprodutivos e o número de filhotes produzidos; o número de eventos reprodutivos e taxa de crescimento; e entre o número de filhotes produzidos e a taxa de crescimento, foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson (p≤0.05).

2.2.3 Histologia do útero grávido

Para elucidar a estratégia apresentada pelos moluscos em relação ao desenvolvimento dos embriões, foi investigada a morfologia do útero grávido. Para o estudo histológico, seis indivíduos adultos foram fixados em Formalina de Carson Milloning (CARSON et al., 1973) e processados seguindo as etapas da técnica histológica convencional. Os cortes de 5μm foram corados por hematoxilina e eosina e observados sob um microscópio de contraste de fase diferencial e interferencial. As imagens dos cortes histológicos foram capturadas através de uma câmera digital acoplada ao microscópio e analisadas com o programa Image Pro Plus 5.0.

2.2.4 Anatomia do útero grávido e relação entre tamanho e características reprodutivas

Para o estudo anatômico, 60 espécimes (30 indivíduos com a idade de 80 dias de vida e 30 indivíduos adultos com diferentes idades), foram fixados em álcool 70% e dissecados sob microscópio estereoscópico. Para verificar a relação entre tamanho e características reprodutivas, foram utilizados 30 indivíduos adultos previamente utilizados no estudo anatômico. Foram medidos o comprimento e a largura da concha, glândula de albúmen e útero, utilizando um paquímetro com 0,1 cm de precisão. Além disso, foram determinados o número de voltas da concha e o número de embriões dentro do útero. Para verificar a existência de correlação entre essas variáveis, foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson (p≤0.05).

2.2.5 Análise do conteúdo de glicogênio e galactogênio em moluscos jovens, adultos e senescentes

O conteúdo de glicogênio e galactogênio na massa cefalopodal, glândula digestiva e glândula de albúmen nos três estágios do ciclo de vida de L. unilamellata, foi analisado utilizando- se os tecidos de 18 moluscos jovens com 65 dias de vida, 24 moluscos adultos, com 145 dias e 9 indivíduos senescentes, com 1064 dias.

Os moluscos foram dissecados sob microscópio estereoscópico. A glândula digestiva, a massa cefalopodal, e a glândula de albúmen foram removidas e armazenadas a -20ºC até o processamento para a determinação de glicogênio e galactogênio. Os tecidos correspondentes a cada órgão foram reunidos em amostras distintas, identificadas, portanto, por órgão e também por estágio de vida. Durante todos os procedimentos, os tecidos foram mantidos resfriados para evitar a deterioração dos carboidratos através da ação enzimática.

Os tecidos foram processados e os precipitados de glicogênio e galactogênio obtidos de acordo com a metodologia proposta por PINHEIRO e GOMES (1994). Os precipitados foram

submetidos à hidrólise ácida e subseqüente quantificação espectofotométrica, através da técnica do ácido 3,5 dinitro salicílico (3,5 DNS) (SUMNER, 1924), com leitura de absorbância a 535 nm. Os

valores finais foram calculados através da lei de Beer com pelo menos três leituras coerentes, e expressadas em mg de glicose/g de tecido ou mg de galactose/g de tecido (peso fresco).

2.3 RESULTADOS