3.1. Amostras
Foram incluídas neste estudo, aves (Gallus gallus domesticus) de produção (corte e postura) e de subsistência, as quais foram submetidas a exame post-mortem e/ou análise histopatológica, dentre outros exames realizados no setor de Patologia Veterinária do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias (DCCV) e no laboratório de doenças das aves do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (EV-UFMG). O estudo foi retrospectivo e prospectivo e o período de amostragem compreendeu o período de janeiro de 2006 a janeiro de 2021 (15 anos).
Duzentas e quarenta e três aves foram incluídas, das quais, 28 apresentaram dois diagnósticos distintos. Também foram incluídos 29 casos referentes a “pool” de fígados e outros tecidos.
Assim, cada “pool” foi contabilizado como sendo um caso/ave, totalizando assim 300 casos/diagnósticos (Tabela 2). Estas amostras pertenciam a criações localizadas em Minas Gerais, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Distrito Federal.
Tabela 2. Relação de amostras de aves domésticas diagnosticadas com alterações hepáticas incluídas neste estudo.
Ave Nº (aves) Aves com dois diagnósticos Nº (pools) Total de casos
FC 124 13 23 160
GP 89 9 5 103
AS 30 6 1 37
Total geral 243 28 29 300
Legenda: Nº= número. FC= frango de corte. GP= galinha de postura. AS= ave de subsistência.
3.2. Coleta de dados
Foram recuperados do arquivo do Laboratório de Patologia Veterinária da EV-UFMG todos os laudos anátomo-histopatológicos de aves domésticas, juntamente com os dados referentes a cada ave. Foram incluídos neste estudo os casos onde se obteve o diagnóstico de alteração ou doença hepática por necropsia e histopatologia de rotina, além de diagnósticos confirmados por
38 técnicas bacteriológicas, moleculares, imuno-histoquímicas e histoquímicas. A microscopia eletrônica foi utilizada para um tipo de diagnóstico.
3.3. Necropsia e histopatologia
As necropsias foram realizadas no setor de Patologia da EV-UFMG, seguindo os padrões referentes à espécie. Quando necessário, a eutanásia foi realizada pelo método de deslocamento cervical no “Guia Brasileiro de Boas Práticas para Eutanásia em Animais”, Lei nº 5.517, de 23 de outubro de 1968, Resolução CFMV nº 1000/2012 (GUIA BRASILEIRO DE BOAS PRÁTICAS EM EUTANÁSIA EM ANIMAIS, 2012). Durante a necropsia foi realizada a avaliação macroscópica dos órgãos com descrição detalhada das lesões encontradas. Em muitos casos, as necropsias foram realizadas nas granjas/propriedades, sendo encaminhadas amostras pelos veterinários/proprietários com a finalidade de diagnóstico histopatológico (somente amostras fixadas em formalina 10%), assim impossibilitando a realização de outros exames complementares, tais como o bacteriológico.
Para a histopatologia, foram coletadas amostras de fígado e outros tecidos que eventualmente apresentavam alterações, variável de acordo com o caso. Estas amostras foram submetidas à técnica de processamento histológico de rotina, conforme Luna (1968). Inicialmente foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% por 48 horas, clivadas e processadas em séries crescentes de álcool, xilol, seguidas de inclusão em parafina, seccionadas no micrótomo a 4,0 μm de espessura e posteriormente coradas pela hematoxilina e eosina (HE). Em seguida, estas amostras foram analisadas em microscopia de luz branca. Quando possível, exames auxiliares foram utilizados de acordo com a indicação após exame macroscópico e/ou histopatológico. Os exames incluíram colorações especiais, imuno-histoquímica, bacteriologia, PCR e microscopia eletrônica.
3.4. Histoquímica
Coloração especial pelo ácido periódico de Schiff (do inglês Periodic Acid-Schiff; PAS), vermelho congo, Azul da Prússia (Perls) e tricrômico de Masson (Prophet et al., 1992) foram realizadas em alguns fígados com lesões macroscópicas e histológicas sugestivas de processos degenerativos como degeneração glicogênica, hepatite protozoária, como histomoníase, processos metabólicos, como amiloidose e hemossiderose e processos crônicos (fibrose), respectivamente. Nos casos onde realizou-se vermelho congo, as amostras foram analisadas em microscopia de luz polarizada.
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3.5. Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica para identificação in situ do gênero Salmonella foi realizada na EMBRAPA suínos e aves (Concórdia, Santa Catarina), em fígado e baço de três casos, utilizando um anticorpo policlonal Salmonella polivalente (Probac do Brasil, São Paulo, SP). A diluição utilizada foi de 1:2.000. Cortes histológicos de 3 µm sobre lâminas silanizadas foram deparafinados em estufa a 60ºC por 30 minutos, seguidos por dois banhos de xilol, com 15 minutos cada. Em sequência, foi realizada reidratação com dois banhos em álcool absoluto, um banho em álcool 90% e em álcool 80%, cinco minutos cada. Por fim, em água destilada por 10 minutos. A recuperação antigênica foi realizada com 40 ml do tampão citrato em 360 ml de água destilada, a 95ºC por 10 minutos. Em seguida, as lâminas foram resfriadas a temperatura ambiente, por 20 minutos. Na etapa de bloqueio da peroxidase endógena, diluiu-se 90 ml de peróxido de hidrogênio em 180 ml de metanol. Em sequência, ocorreu o bloqueio de ligações inespecíficas, diluindo 0,5 g de leite em pó em 20 ml de PBS, aquecendo em microondas por 10 segundos. As lâminas foram colocadas em câmara úmida, cobrindo todo o corte com o soro bloqueio, mantendo em temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente, ocorreu a diluição do anticorpo primário, o qual foi disposto sobre a lâmina cobrindo todo o tecido e posterior incubação a 4ºC por 16 horas (overnight). Após esta etapa, realizou-se a incubação com anticorpo secundário com o sistema comercial Envision Dual Link (Leica Biosystems), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Para a revelação, dilui-se 20 µl de 3.3’-diaminobenzidina (DAB) em 1 ml de substrato, cobrindo todo o tecido com a solução, deixando as lâminas na câmara úmida em temperatura ambiente por 30 minutos. As lâminas foram lavadas com água corrente por 10 minutos, contracoradas com hematoxilina por 4 segundos e, posteriormente, desidratadas e montadas para serem lidas em microscópio de luz branca.
3.6. Bacteriologia
Amostras de fígados e eventualmente outros tecidos (baço e/ou músculo peitoral) de aves com suspeita de infecção bacteriana, obtidas durante exame de necropsia ou recebidas resfriadas, foram coletadas ou amostradas de forma asséptica, maceradas e semeadasem cultivo bacteriano aeróbico em meio Ágar Soja Tripticaseína (TSA; Kasvi), contendo 5% de sangue ovino e em meio Ágar MacConkey (MCC; OXOID) (Braga et al., 2016) e, em seguida, incubadas a 37 °C por 24 a 72 horas. Adicionalmente, foram realizados testes de catalase e oxidase. Por fim, os isolados foram identificados pelo equipamento Microflex MALDI Biotyper (Empresa BD/Bruker) (Leão et al., 2018). Para pesquisa de Salmonella spp. foi utilizado o protocolo recomendado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Brasil, 1995).
Fragmentos de aproximadamente 2 g de fígado e baço foram colocados em tubos estéreis com 18
40 mL de caldo de infusão de cérebro (BHI; OXOID) que foram incubados a 37 ° C por 24 h. Depois disso, as amostras foram semeadas em placas de ágar MacConkey (MCC; OXOID) e verde brilhante (VB; OXOID), as quais foram incubadas a 37 °C por 24 horas. Após o período de incubação, realizou-se a avaliação das características morfológicas das colônias obtidas. Cerca de cinco colônias de cada amostra apresentando características sugestivas de Salmonella spp. foram submetidas à triagem bioquímica em ágar triplo açúcar ferro (TSI, OXOID), ágar lisina ferro (LIA, OXOID), ágar sulfeto indol motilidade (SIM, KASVI) e ureia. Aquelas com perfil bioquímico compatível com Salmonella spp. foram submetidas a sorologia (inclusive de S.
Gallinarum ou S. Pullorum). Para isso, foram semeadas em ágar BHI (OXOID) e, em seguida, testados com soros polivantentes ati-antígenos somáticos (O) e flagelares (H) de Salmonella spp.
(Probac). Colônias com características de S. Gallinarum ou S. Pullorum (imóveis, pouca ou ausência de produção de H2S e negativas na sorologia para antígenos H) foram ainda submetidas à genotipagem para confirmação de S. Gallinarum ou de S. Pullorum, seguindo a metodologia descrita por Batista et al. (2016) a seguir. As demais colônias foram identificadas como Salmonella spp.
3.7. Genotipagem para identificação de Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo Gallinarum biovar Gallinarum ou Pullorum
Para a genotipagem, primeiramente foi realizada a extração do DNA bacteriano, como detalhado a seguir.
3.7.1. Extração do DNA bacteriano
No dia anterior ao procedimento de extração, as colônias sugestivas de S. Gallinarum ou S. Pullorum foram semeadas em tubos contendo 10 mL de caldo lisogenia (LB, BD Difco) os quais foram incubados a 37 °C por 18 horas. O material genético das estirpes selvagem e mutante de SG foi extraído conforme metodologia descrita por Marmur (1961), com modificações. A composição do tampão de lise utilizado possuiu a seguinte composição Tris-HCl (pH 8) (100 mM), EDTA (pH 8) (50 mM), NaCl (100 mM) e SDS (0,5 %).
Após o período de incubação foi aliquotado 1 mL da cultura em um microtubos de 2 mL os quais foram centrifugados a 9.659 x g por 5 minutos em minicentrífuga (Eppendorf). O sobrenadante de cada tubo foi descartado e o sedimento ressuspendido em 700 μL de tampão de lise após homogeneização em agitador vórtex. Os microtubos foram colocados em termobloco (VHD) previamente aquecido a 65 °C e mantidos a essa temperatura. Em intervalos de 15 minutos, os microtubos eram agitados vagarosamente por inversão. Ao final de 1 hora de incubação, as amostras foram esfriadas em temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente,
41 350 μL de acetato de potássio (Synth) (5 M, pH 8) a 4 °C foi adicionado em cada microtubo e o conteúdo foi agitado suavemente até obter um coágulo de aspecto leitoso. Logo após, os microtubos foram imersos em gelo triturado por 30 minutos, sendo inversos somente uma vez durante esse período. Ao final, foram adicionados 700 μL de solução de clorofórmio (Synth) e álcool isoamílico (Synth) na relação 24:1 a 4 °C e os microtubos foram agitados por inversão por 5 minutos. As amostras foram centrifugadas a 9.659 x g por 10 minutos e a mistura ficou dividida em três fases. Dessa forma, foi transferido somente o sobrenadante da primeira fase para o novo microtubo estéril de 2 mL. Posteriormente, adicionou-se 1 mL de etanol absoluto (Synth) a 4 °C e as amostras foram agitadas vagarosamente por inversão por 10 vezes. Ao término, os microtubos foram acondicionados em freezer a -20 °C overnight. No dia seguinte, as amostras foram colocadas a temperatura ambiente, invertidas suavemente por cinco vezes e centrifugadas a 9.659 x g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e 1 mL de etanol 70 % (v/v) foi adicionado.
Imediatamente, os microtubos submetidos à centrifugação por 9.659 x g por 15 minutos e o sobrenadante foi descartado. Os sedimentos foram secos em termoboloco previamente aquecido a 37 °C por 30 minutos, aproximadamente. As amostras de DNA purificadas foram eluidas em 50 μL água ultrapura (Sigma-Aldrich) e, posteriormente, acondicionadas a 4 °C overnight. Ao término, a qualidade nas relações 260/230 e 260/280 e a quantidade (ng/μL) de DNA cromossomal foram mensuradas por meio de espectofotometria em aparelho NanoVue® (GE, Healthcare).
3.7.2. PCR duplex
O DNA extraído das amostras foi submetido à amplificação pela reação em cadeia da polimerase com um conjunto de dois pares de primers, conforme descrito por Batista et al. (2016).
Os primers utilizados amplificam simultaneamente duas regiões cromossomais. O primeiro segmento, denominado de região identificadora do sorotipo (RIS) é uma região única do sorovar Gallinarum. O segundo conjunto amplifica o gene ratA que é polimórfico, permitindo diferenciar em biovar Gallinarum ou Pullorum. O produto dos oligonucleotídeos RIS: Forward 5´-TACGGGACGAGTGGGTACTT-3 e Reverse – 5´-AGATGCCCCACCACTCAAAG)-3´apresenta tamanho de 543 pares de bases (pb). O amplicon gerado pelos oligonucleotídeos ratA:
Forward 5´- GACGTCGCTGCCGTCGTACC-3´ e Reverse 5´-
TACAGCGAACATGCGGGCGG-3´ diferencia os dois biovares, por resultar em um amplicon de 1.047 pb para o biovar Gallinarum ou de 243 pb para o biovar Pullorum.
O ensaio de PCR duplex foi estabelecido com volume final de 25μL contendo: 20ng de DNA, tampão 1X (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 100mM KCl – Phoneutria), 240μM de dNTP (Phoneutria), 3,6mM de MgCl2 (Phoneutria), 0,8μM de cada iniciador, 1,25 Unidade de Taq
42 Polimerase (Taq DNA Polymerase – Phoneutria) e água ultra pura q.s.p. A PCR foi realizada em termociclador modelo A4 85-264VAC (Nyx Technik, San Diego, California).
As condições de amplificação foram de um ciclo inicial de desnaturação a 94oC por 3 minutos, seguido por 26 ciclos de desnaturação a 94oC por 45 segundos, pareamento a 63oC por 45 segundos e extensão a 72oC por 1 minuto, e extensão final a 72oC por 7 minutos. Foram utilizados como controles positivos, DNAs extraídos da colônia de referência Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo Gallinarum biovar Gallinarum estirpe 287/91 e de Salmonella enterica subsp. enterica sorotipo Gallinarum biovar Pullorum estirpe ATCC 9120. Como controles negativos, DNAs extraídos de fígado de aves livres de patógeno específicos e DNA extraído da colônia de referência Escherichia coli ATCC 25922.
3.8. Extração de DNA pelo método sílica
Foi executado método de extração de DNA com a finalidade de obter amostras de DNA do adenovírus aviário em cinco amostras de frangos com lesões histológicas indicativas de adenovirose. Para a extração de DNA total em amostras de fígados, baços e timo, foi utilizado um protocolo a base de iodeto de sódio (NaI) 6M (Vogelstein e Gillespie, 1979; Boom et al., 1990) e dióxido de silício (Boom et al., 1990). Posteriormente, o DNA total de cada amostra foi acondicionado em microtubo estéril e armazenado a -20ºC até a realização da PCR para detecção do gene hexon do adenovirus aviário.
3.9. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
O DNA extraído foi submetido ao teste de PCR utilizando-se condições de reação e oligonucleotídeos para adenovírus aviário, de acordo com o método descrito por Meulemans et al. (2001). Para amplificação parcial dos ácidos nucleicos do gene da proteína hexon do adenovírus, foram utilizados os pares de primers: Forward 5'- CAARTTCAGRCAGACGGT-3' e Reverse 5'-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3', os quais resultaram em um produto de 897 pares de base (pb) (Meulemans et al., 2001). Para controle positivo foram utilizadas amostras previamente confirmadas para este agente. Para o controle negativo, o DNA foi substituído por água ultrapura. Para detecção do DNA do vírus da anemia infecciosa das galinhas (do inglês Chiken anemia virus- CAV), foi realizado nested PCR, de acordo com Cadorna et al. (2000). Para isso, para amplificar um segmento do gene VPI, foram utilizados primers externos O3F: 5'-(CAAGTAATTTCAAATGAACG)-3' e O3R: 3'-(TTGCCATCT TACAGTCTTAT)-5' e primers
internos N3: 5'-(CCACCCGGACCATCAAC)-3' e N4:
3'-(GGTCCTCAAGTCCGGCACATTC)-5', resultando em um produto de 183 pares de base (pb).
43 Os produtos amplificados foram analisados pelo sistema de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, 100V em TBE (Tris-base 100mM pH8,3, EDTA 25mM e ácido bórico 50mM). O DNA foi revelado por transiluminação do gel (Biotium, EUA) em luz ultravioleta (280nm). O tamanho dos produtos amplificados (897 pb e 183 pb, respectivamente) foram comparados a um padrão de peso molecular.
3.10. Sequenciamento
O produto amplificado por PCR para o adenovírus aviário foi sequenciado pelo Big Dye Terminator Mix (Aplicado Biosystems, EUA), em um sequenciador capilar automatizado (ABI 310, Applied Biosystems), seguindo as recomendações do fabricante.
3.11. Microscopia eletrônica (ME)
Fígados fixados em formalina tamponada, diagnosticados com amiloidose acentuada pela histopatologia e histoquímica, foram seccionados em fragmentos menores, lavados em água destilada e pós-fixados em glutaraldeído diluído em solução tampão de PBS. Em seguida, as amostras foram lavadas, desidratadas com série de álcoois graduados, introduzidas em resina, cortadas em secções ultrafinas, colocadas em grades de cobre e contrastadas, conforme descrito por Nakayama et al. (2017). Por fim, foram analisadas em microscópio eletrônico de transmissão e as imagens obtidas de forma digital. O processamento foi realizado no centro de microscopia eletrônica da Universidade Federal de Minas Gerais.