MATERIAL E MÉTODOS 1 Material Vegetal e Liquênico

Cladonia verticillaris, espécie de líquen endêmica do Brasil, foi coletada manualmente no município de Saloá (PE) a 273 km de Recife, área de Cerrado – tabuleiro de interior), e acondicionada em caixas de papel à temperatura ambiente (28º±3ºC), até a realização dos experimentos. O material foi identificado e sua exsicata depositada no herbário UFP do Departamento de Botânica da UFPE com o registro 52.299. Parmotrema dillatatum (Vainio) Hale, usada para extração do ácido protocetrárico (PRO) foi coletada no mesmo local, sendo seu registro 39.893. Sementes de Lactuca sativa var. Grand Rapids L. foram adquiridas comercialmente da Isla Pak, Porto Alegre, Brasil.

2.2 Irradiação gama de Cladonia verticillaris

Amostras liquênicas foram colocadas em envelopes de papel e submetidas à radiação em irradiador gama (Co-60 – irradiador, Radionies Laboratory), recebendo doses de 10, 50 e 100 Gy com taxa de dose: de 6,912 kGy/h. Como controle foram utilizadas amostras não submetidas à fonte radioativa.

2.3 Extração dos aleloquímicos de Cladonia verticillaris

Talos liquênicos irradiados (doses de 0, 10, 50 e 100 Gy) foram submetidos à extração em série em um aparelho de Soxhlet com éter, clorofórmio, acetona e metanol de acordo com a série eluotrópica. Os solventes foram obtidos da Vetec Química Fina LTDA, Duque de Caxias, RJ, Brasil. Para cada 2,0 L de cada solvente, foram utilizados 150 g de C. verticillaris. Após a extração, as soluções foram filtradas e evaporadas a vácuo.

2.4 Isolamento e purificacação do ácido fumarprotocetrárico (FUM) e ácido protocetrárico (PRO)

164 O principal componente da espécie em estudo, o FUM, foi isolado e purificado a partir do extrato acetônico (EA) de C. verticillaris. Este, após concentrado foi lavado em funil poroso G-4 com acetona, como descrito por Pereira (1998). PRO foi extraído do líquen Parmotrema dilatatum (Vain.) Hale, utilizando diclorometano, seguido por acetona a temperatura de aproximadamente 45°C, como descrito por Tigre et al. (2012). A atranorina (ATR) foi obtida comercialmente na Sigma Química LTDA, Brasil.

2.5 Separação e quantificação dos aleloquímicos de Cladonia verticillaris

A separação e quantificação dos aleloquímicos majoritários de C. verticillaris foi realizada por RP-HPLC em um cromatógrafo líquido usando Spectra Physics 8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), equipado con uma bomba SP 8810, um injetor Rheodine, um detector UV-Visível SP8490 e o programa DateApex Clarity Lite ™ para Windows (DateApex Ltda., Praha, Czech Republic) para obtenção e integração dos dados. Os extratos etéreos (EE), clorofórmicos (EC), EA e metanólicos (EM) irradiados ou não irradiados foram dissovidos em fase móvel antes de serem injetados. As condições de análises foram: Coluna de fase reversa (RP), Mediterranea Sea C18 de Teknokroma, S.C.L., Espanha; dp 5 µm, L, 120 mm; d.i. 4,6 mm; pressão em coluna, 70 bar. Fase móvel [acetonitrila]:[acetronitrila: ácido acético a 4% em água Mili-Q (80:20, v/v)] [ 70:30, v/v], isocrática a 1 mL·min-1. Volume de injeção: 10 µ L. Temperatura 22oC±0,1oC. Comprimento de onda: 254 nm. Taxa de detecção: 0,0005 unidades (Santiago et al., 2008). A quantificação de ATR, FUM e PRO se realizou por meio da interpolação da resposta do detector, em contas de área e na correspondente reta de calibração. Esta foi construída com cada aleloquímico, calculando a relação entre a conta de área obtida a partir de concentrações crescentes de cada composto (entre 290 e 400 µ g·mL-1 para FUM, 10-500 µ g·mL-1 para PRO e 30-400 µg·mL-1 para ATR).

2.6 Bioensaio de germinação (Pré-emergente)

Os testes foram realizados em placas de Petri de 9 cm de diâmetro contendo duas folhas de papel de filtro umedecidas com 5 mL por placa com EE, EC, EA e EM a 1,0 e 2,5 g.dm-3 e de FUM e PRO a 0,1 e 1,0 g.dm-3, distribuídos uniformemente. As placas com os papéis foram esterilizadas. O controle negativo foi obtido com o uso de água destilada e o controle positivo pela utilização do herbicida clortoluron (HC) na

165 concentração 0,1 e 0,2 g.dm-3. Posteriormente foram semeadas em cada placa 50 sementes de L. sativa. O experimento foi conduzido em câmara de germinação com temperatura de 22oC±0,2, fotoperíodo de 12 h e umidade relativa de 75% por um período de 12 dias.

2.7 Bioensaio de crescimento (Pós-emergente)

Foi realizado semelhante ao bioensaio pré-emergente, porém as sementes foram germinadas previamente em água destilada até a protusão radicular de 2 mm (Brasil, 2009) e somente depois transferidas para as soluções-teste. As plântulas foram incubadas por 13 dias após o transplante.

2.8 Isolamento das membranas tilacoidais e medida da reação de Hill

A preparação da suspensão das lamelas cloroplastídicas foi realizada de acordo com o protocolo de Trebest (1972) com modificações que consistiu na maceração a frio de 40 mg de folhas de L. sativa em 1mL de tampão fosfato sódico (TFS) 25mM pH 6,9, contendo KCl 30 mM e sacarose 400 mM. Este homogenado foi centrifugado a 1.000 G durante dez min. Posteriormente o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 1mL de tampão supracitado.

A quantificação da reação de Hill foi realizada na mistura de 500 µ L da suspensão de lamelas tilacoidais e 500 µ L de TFS mM, pH 6,9. Em espectrofotômetro, uma vez ajustado o “zero” de absorbância a 600nm, se adicionaram 75 µL de 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) 0,52 µM e imediatamente submeteu-se a amostra a uma fonte luminosa de 750 µmol.m-2.s-1 a uma distância de 20 cm, calculando o delta de absorbância em função do tempo (Trebest, 1972). A atividade do Fotossistema II (PSII) foi expressa pela variação da abosrbância a 600nm por minuto e µg de clorofila a+b.

2.9 Determinação dos pigmentos fotossintéticos

Alíquotas de 400 µ L da suspensão de lamelas cloroplastídicas, isoladas segundo o protocolo citado no item 2.8, foram adicionadas a 400 µ L de acetona P.A. A amostra foi agitada em vórtex e centrifugada a 8.500 x g durante 10 min, descartando o pellet após centrifugação. Foram realizadas leituras no sobrenadante nas absorbâncias a 480, 649, 665 e 710 nm em espectrofotômetro Unicam Heλios β (Thermo Fisher

166 Sci.Inc., Rockford, IL, USA), o branco consistiu em acetona a 50% (v/v). A concentração de moléculas de pigmentos foi calculada usando as expressões descritas por Pompelli et al. (2013).

2.10 Determinação das atividades enzimáticas peroxidase, poliefenoloxidase e catalase

2.10.1 Obtenção dos extratos livres de células (ELC)

ELC foi obtido através da maceração a frio de 40 mg de folhas da planta teste em 1 mL de TFS 75 mM, pH 6,9. O homogenato foi centrifugado a 19.000 x g por 20 min., a 4ºC. Posteriormente o pellet foi descartado e no sobrenadante foram quantificadas as atividades enzimáticas e o teor de proteínas.

2.10.2 Determinação da concentração de proteínas

A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951) com modificações para eliminação do excesso de fenóis (Potty, 1969). Para isto, foram utilizados 200 µL de ELC que foram precipitados com 100 µL de ácido tricloroacético (TCA) a 10% (p/v) e centrifugado a 15.000 x g por 15 min. a 4ºC. Posteriormente o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido com 300 µ L de TFS mM, pH 6,9, sendo neutralizado com 22 µ L de NaOH 0,1 N. A partir deste extrato foram quantificadas as proteínas pelo método de Lowry et al. (1951) utilizando soroalbumina bovina como padrão.

2.10.3 Determinação das atividades enzimáticas 2.10.3.1 Atividade peroxidase – POD (EC 1.11.1)

Alíquotas de 50 µ L de ELC foram adicionadas a 440 µ L de TFS 75 mM, pH 6,9 e 50 µ L de pirogalol 200 mM. Essa mistura foi homogeneizada e imediatamente foram realizadas medidas de absorbância a 420nm a 25ºC, ajustando a “zero”. Posteriormente foram adicionados 50 µ L de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 200 mM, medindo-se em

seguida a variação de absorbância no tempo para medir a formação de purpurogalina.

167 Para mistura desta reação foram utilizadas 400 µL de TFS 75 mM, pH 6,9 e 50 µ L de ELC que foram medidos a 420 nm a 25ºC ajustando a “zero” de absorbância. Em seguida, foram adicionados 50 µ L de pirogalol 200 mM, medindo a quantidade de purpurogalina formada em função do delta de absorbância em relação ao tempo.

2.10.3..3 Atividade catalase – CAT (EC 1.11.1.6)

A mistura desta reação foi obtida por 400 µL de TFS 75 mM, pH 6,9 e 50 µ L de ELC. Uma vez homogeneizada, se ajustou o “zero” de absorbância a 240nm a 25ºC e em seguida foram adicionados 50 µ L de H2O2 200 mM medindo a absorbância a cada

30 s, por 5 min.

As atividades enzimáticas de POD, PPO e CAT foram determinadas pelo método descrito por Kar e Mishra (1976) com as modificações descritas nos itens 2.10.3.1, 2.10.3.2 e 2.10.3.3, respectivamente. A unidade da atividade específica de cada enzima se definiu pela variação de absorbância em função do tempo, por massa (mg) de proteínas.

2.11 Análises estatísticas

Todos os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente ao acaso com três repetições. As médias foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e quando os efeitos foram significativos, aplicou-se o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.

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3. RESULTADOS E DISCUSSÃO