MATERIAL E MÉTODOS Sujeitos

Foram utilizadas seis fêmeas adultas de sagüi comum (Callithrix jacchus) do Núcleo de Primatologia do departamento de Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Essas fêmeas foram escolhidas a partir de um total de dez fêmeas que tiveram o seu ciclo ovulatório acompanhado de abril a maio de 2007, sendo selecionadas três fêmeas exibindo ciclo ovulatório regular e três não exibindo ciclo

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ovulatório para o estudo. A idade dos animais variou entre 1,5 e 7 anos com média de quatro anos. Cada fêmea foi mantida isolada em um recinto vizinho ao de um macho adulto. Essas gaiolas adjacentes eram separadas por uma fina camada de madeira, de forma a permitir que a fêmea entrasse em contato com os odores e os sons do macho vizinho sem que houvesse contato visual e físico direto entre eles.

Medidas hormonais

As fezes dos animais foram coletadas três vezes por semana (segunda, quarta e sexta) sempre entre 5:30 e 9:00h da manhã, período de maior ocorrência de defecações (Castro & Sousa, 2005), de forma a minimizar a variação circadiana na progesterona fecal.

As amostras foram armazenadas em um tubo plástico de 3,0 ml, identificadas e armazenadas em gelo até serem levadas ao freezer, sendo analisadas no laboratório de Medidas Hormonais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Primeiramente, foi pesado 0,1 g da amostra de fezes e, em seguida, foi feita a extração com 5ml de etanol. Uma parte foi retirada para solvólise ácida e extração por acetato e depois ressuspendida em etanol e armazenada até quantificação. Os ensaios de quantificação utilizaram um método de EIA validado (Sousa e Ziegler, 1998). O coeficiente de variação dos ensaios foi 3,96% para intra-ensaio e 12,24% de variação entre ensaios.

Um ciclo hormonal foi estabelecido quando uma fêmea apresentou níveis de progesterona 1,5 vezes mais elevados que o valor basal, em 4 ou mais medidas consecutivas, precedidas por valores basais por pelo menos três medidas, conforme proposto por Ziegler e Sousa (2002). A ovulação ocorre de 2 a 4 dias antes do início do aumento na concentração de progesterona nas fezes e, antes e depois da ovulação

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ocorrem, respectivamente, a fase folicular (8 dias) e a fase luteal (19 dias) (Hearn, 1983).

Medidas de coloração

Três vezes por semana (de quarta a sexta) os espectros de coloração foram mensurados com auxílio de uma fibra óptica (R400-7-VIS/NIR) conectada a um espectofotômetro portátil USB 4000, acoplado a uma fonte luminosa LS1 de halogênio- tungstênio (os três da empresa Ocean Optics, Dunedin - FL, EUA) e a um notebook com o software SpectraSuite© (Ocean Optics, Dunedin - FL, EUA). As medidas de cada dia foram calibradas usando um branco padrão (pó de sulfato de bário), uma superfície com alta reflexão da luz em todos os comprimentos de onda visíveis, para o claro e o bloqueio total da luz para o escuro. As medidas foram feitas entre 400 e 700 nm em intervalos de 0,2 nm.

O espectro de irradiância da iluminação natural (ou iluminante) utilizado nos cálculos foi obtido com o espectofotômetro calibrado para um padrão de luz conhecido (LS1 - CAL; Ocean Optics, Dunedin, FL, EUA) e com um corretor de cosseno (CC3, Ocean Optics) acoplado à fibra óptica (QP 400-2-VIS/NIR, Ocean Optics, Dunedin, FL, EUA). O iluminante foi medido no Parque das Dunas, Natal – RN, região habitada pela espécie estudada (Figura 1 A).

Durante um mês, foram tomadas medidas da coloração refletida a partir da pele das superfícies da face (ao lado do nariz e abaixo do olho), da genitália e da barriga das fêmeas de sagüi (exemplos de padrão de refletância: Figura 1 B, C e D). As colorações foram obtidas sempre com a fibra óptica na mesma distância e com ângulo de 90o em relação às superfícies com o auxílio de um suporte KS1 para fibra óptica (Ocean Optics, Dunedin, FL, EUA). Durante a medição dessas refletâncias, os animais foram

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imobilizados com o auxílio de um tratador treinado e foram manipulados de forma a evitar estresses desnecessários.

Figura 1. Espectros do iluminante utilizado (A) e exemplo de cada superfície corporal medida: genitália (B), face (C) e barriga (D).

Modelagem da coloração

Para analisar como os animais estão enxergando o estímulo mensurado utilizou- se um modelo matemático criado a partir dos aspectos fisiológicos da visão do animal e das características espectrais da luz incidente. O primeiro passo nesse modelo é descobrir quanto de luz cada fotorreceptor está captando (captação quântica) e isso é feito multiplicando o espectro de refletância da luz nas superfícies medidas pela curva de sensibilidade dos cones na retina e pelo espectro do iluminante. O cálculo da captação quântica de cada fotorreceptor é representado pela fórmula:

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Onde Qi é a captação quântica do cone i; λ é o comprimento de onda; Ri(λ) é o espectro de refletância da superfície; S(λ) é a curva de sensibilidade dos cones; I(λ) é o espectro do iluminante; λmin = 400nm e λmáx = 700nm. (Vorobyev et al.,1998). Para o cálculo das captações quânticas dos cones utilizou-se uma rotina elaborada no software estatístico R versão 2.8.

A curva de sensibilidade de cada cone isolado é calculada pelo polimônio derivado empiricamente por Baylor et al. (1987):

Nessa equação Si é a sensibilidade do cone i para cada λ; an representa os valores de n de 0 a 6 (a0 = -5,2734, a1 = -87,403, a2 = 1228,4, a3 = -3346,3, a4 = 5070,3, a5 = 30881 e a6 = -31607); λmáx é o pico de sensibilidade do cone i em nm; λ representa os comprimentos de onda da curva do fotorreceptor. No entanto, esta fórmula se refere apenas a uma fina camada da retina, onde está presente o fotopigmento, mas até chegar nessa camada a luz já foi filtrada pelo próprio fotorreceptor e por outras células na retina. Para se descobrir a sensibilidade dos cones na retina (Sri(λ)) utilizamos a seguinte equação, considerando a densidade óptica dos cones igual a 0,3 (Summer & Mollon, 2000a):

A influência do cristalino e da mácula lutea no sinal recebido pelos fotorreceptores foi desconsiderada, pois esses meios agem como filtros de comprimentos de onda abaixo de 400 nm (Summer & Mollon, 2000a).

A captação quântica dos fotorreceptores da retina é interpretada em conjunto na forma dos eixos de oponência cromática e de luminância ao ser enviado ao cérebro.

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Para representar esses canais visuais calculamos: QS/(QL+QM), que é o canal de oponência azul-amarelo; QL/(QL+QM), que é o canal de oponência de verde-vermelho; e QL+QM, queé o canal de luminância. Os tricomatas apresentam os três canais, mas os dicromatas não possuem o canal de oponência verde-vermelho, sobrando só QS/QM/L (azul-amarelo) e QM/L (luminância). O valor do cone curto (S) é de difícil mensuração, devido ao pequeno número e tamanho desses cones e dificuldade de isolá-los, por isso, estudos realizados relatam variação de 420 a 435nm (Jacobs, 1996). Em nosso estudo consideramos o valor de S igual a 430 nm. Os valores de M e L vão depender das combinações de 543, 556 e 562 nm (Jacobs, 2007).

Para averiguar se as cores de duas superfícies são perceptivelmente diferentes, considerando os aspectos fisiológicos da retina, usamos um modelo matemático baseado em unidades de diferenças minimamente perceptíveis (JND – just noticeable

differences). Tipicamente, 1 JND consiste na menor diferença perceptível, com certa

precisão, entre um estímulo e seu background (Sperling & Harwerth, 1971). As distâncias cromáticas para dicromatas e tricromatas são calculadas respectivamente pelas fórmulas (Vorobyev & Osório, 1998):

e

Onde ∆S é a distância entre o par de cores em relação à estimulação de todos os fotorreceptores, corrigindo-se o ruído do cone; ƒi =ln(Qi); ∆ƒi é a diferença entre as duas superfícies em relação ao fotorreceptor i e ei é o ruído do fotorreceptor i. Para a

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condição de iluminação intermediária: ei = (1/Qi + ωi2) 0,5

(Osorio et al., 2004). Esse modelo foi desenvolvido para se analisar a detecção de frutos contra um fundo de folhas verdes (Osório & Vorobyev, 1996). Nesse trabalho utilizou-se a comparação entre a cor da genitália e da barriga.

Análise Estatística

A ativação nos eixos de oponência visual e a performance dos fenótipos visuais teve distribuição normal (Kolmogorov-Smirnov). Já a concentração de progesterona não teve e foi transformada com logaritmo para atingir a normalidade. A associação entre a ativação nos eixos de oponência cromática e de luminância modelados para cada superfície medida e a concentração de progesterona foi testada com correlação de Pearson. Para analisar quais eixos de oponência melhor captam as variações de progesterona foi aplicada uma regressão múltipla com os eixos de oponência de cada fenótipo visual e a concentração de progesterona como variável dependente. Na regressão foram analisados os valores do teste de VIF e de Durbin-Watson para averiguar a existência de multicolinearidade (correlação entre as variáveis), homossedasticidade (correlação entre os resíduos das variáveis) e auto-correlação serial dos resíduos (variação não aleatória dos resíduos de uma variável). Os valores de JND da genitália versus barriga foram comparados com a concentração de progesterona através de correlação de Pearson. Todas as análises foram realizadas no pacote estatístico SPSS 16.0.

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RESULTADOS

De forma geral, a ativação dos eixos de oponência cromática esteve correlacionada com a concentração de progesterona, enquanto que o eixo de luminância não apresentou correlação (Tabela 1).

Em relação ao eixo azul-amarelo a correlação da coloração da pele com a concentração de progesterona circulante é negativa, ou seja, a região analisada torna-se mais azulada ou menos amarelada à medida que os níveis hormonais diminuem (Figuras 2 e 3). Essa correlação é mais forte para a região da genitália, mais fraca para a região da barriga e ainda menor para a região da face (Tabela 1).

Já em relação ao eixo verde-vermelho a correlação entre a coloração da pele e a concentração de progesterona circulante é positiva, ou seja, quanto menores forem as concentrações de hormônio mais esverdeada ou menos avermelhada serão as regiões de pele (Figuras 3). Essa correlação é mais forte para a genitália, mais fraca para a face e ainda menor para a barriga (Tabela 1). A cor da genitália nos dois eixos de oponência cromática também é a que está mais ajustada às variações nos níveis de progesterona, apresentando menores desvios da reta de tendência central (Figuras 2 e 3).

Em resumo, no momento da ovulação a pele do animal vai ter uma coloração mais azul-esverdeada ou menos vermelho-amarelada.

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Tabela 1. Valores das correlações de Pearson, com os respectivos valores de p, entre a concentração de progesterona e o valor de ativação dos eixos de oponência visual considerando os diferentes tipos de visão de cores em C. jacchus considerando cada estímulo de superfície corporal das fêmeas (n=6). Os valores que apresentam p < 0,05 estão em negrito.

Superfície corporal Visão de cores Fenótipo r* p# r* p# r* p# Barriga dicromata 543 -0,43 0,00 0,23 0,07 556 -0,43 0,00 0,24 0,06 562 -0,43 0,00 0,24 0,06 tricromata 543/556 -0,43 0,00 0,23 0,06 0,30 0,01 543/562 -0,43 0,00 0,23 0,06 0,29 0,02 556/562 -0,43 0,00 0,24 0,06 0,27 0,03 Face dicromata 543 -0,36 0,00 0,05 0,69 556 -0,36 0,00 0,07 0,60 562 -0,36 0,00 0,07 0,57 tricromata 543/556 -0,36 0,00 0,06 0,64 0,37 0,00 543/562 -0,36 0,00 0,06 0,63 0,37 0,00 556/562 -0,36 0,00 0,07 0,58 0,37 0,00 Genitália dicromata 543 -0,55 0,00 0,13 0,29 556 -0,56 0,00 0,15 0,23 562 -0,57 0,00 0,16 0,20 tricromata 543/556 -0,56 0,00 0,14 0,26 0,55 0,00 543/562 -0,56 0,00 0,15 0,24 0,52 0,00 556/562 -0,56 0,00 0,16 0,22 0,44 0,00 Azul-amarelo Luminância Verde-vermelho

# p representa a probabilidade, variando de 0 a 1, que o valor de r seja obtido ao acaso. Consideramos o valor de p<0,05 como um resultado que não ocorreu devido à aleatoriedade.

* r é o coeficiente de correlação de Pearson, que indica o grau de associação entre as variáveis, variando de -1 a +1

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Figura 2. Relação entre eixos de oponência visual do fenótipo dicromata 562 e o logaritmo da concentração de progesterona de seis fêmeas. Em cada gráfico estão presentes as três superfícies corporais medidas com os símbolos: losango para barriga, quadrado para face e triângulo para genitália. Cada conjunto de pontos é representado com a respectiva linha de tendência e o valor de R2, que indica quanto da variação na concentração de progesterona pode ser explicado pelo canal de oponência analisado em uma escala de 0 a 1. O valor de R2b é referente aos pontos da barriga, R2g da genitália e R2f da face..

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Figura 3. Relação entre eixos de oponência visual do fenótipo 543/562 tricromata e o logaritmo da concentração de progesterona de seis fêmeas. Em cada gráfico estão presentes as três superfícies corporais medidas com os símbolos: losango para barriga, quadrado para face e triângulo para genitália. Cada conjunto de pontos é representado com a respectiva linha de tendência e o valor de R2, que indica quanto da variação na concentração de progesterona pode ser explicado pelo canal de oponência analisado em uma escala de 0 a 1. O valor de R2b é referente aos pontos da barriga, R2g da genitália e R2f da face..

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As análises de regressões múltiplas mostraram que sempre em dicromatas o eixo de oponência que explica melhor a variação de cor relacionada à progesterona é o eixo azul-amarelo (Tabela 2). Em tricromatas a variação de cor da barriga também foi sempre explicada pelo canal de oponência azul-amarelo. Já a variação da coloração da face foi melhor explicada pelo eixo verde-vermelho. A coloração da genitália foi melhor explicada tanto pelo eixo azul-amarelo quanto pelo eixo verde-vermelho nos fenótipos 543/556 e 543/562, mas no fenótipo 556/562 o eixo azul-amarelo foi a variável que melhor explicou a variação (Tabela 2).

Tabela 2. Valores das regressões múltiplas entre todos os eixos de oponência cromática e de luminância, para cada fenótipo visual existente de C. jacchus machos e fêmeas, com a concentração de progesterona. Variáveis listadas são boas preditoras de variação (p<0,05).

Tipo de visão Fenótipo Variáveis coeficiente p R2* _{coeficiente p R}2 _{coeficiente p R}2

Dicromata 543 constante 3,71 0,00 0,18 2,96 0,00 0,13 3,91 0,00 0,31 Azul-amarelo -2,43 0,00 -0,91 0,00 -3,40 0,00 556 constante 3,68 0,00 0,18 2,94 0,00 0,13 3,88 0,00 0,32 Azul-amarelo -2,47 0,00 -0,93 0,00 -3,54 0,00 562 constante 3,67 0,00 0,18 2,93 0,00 0,13 3,88 0,00 0,32 Azul-amarelo -2,44 0,00 -0,94 0,00 -3,60 0,00 Tricromata 543/556 constante 3,96 0,00 0,18 -24,94 0,01 0,14 -37,16 0,02 0,38 Azul-amarelo -4,90 0,00 -4,28 0,01 Verde-vermelho 52,96 0,00 78,73 0,01 543/562 constante 3,69 0,00 0,18 -17,95 0,01 0,14 -21,56 0,06 0,37 Azul-amarelo -4,92 0,00 -4,81 0,00 Verde-vermelho 38,90 0,00 48,01 0,03 556/562 constante 3,68 0,00 0,18 -70,73 0,00 0,14 3,88 0,00 0,32 Azul-amarelo -4,96 0,00 -7,14 0,00 Verde-vermelho 144,24 0,00

Barriga Face Genitália

* R2_{representa o quanto da variação na concentração de progesterona é explicada pelas variáveis inclusas em cada modelo de}

regressão

Os valores de distâncias cromáticas, expressos em JND, baseados no contraste de cor existente entre genitália e barriga se apresentaram correlacionados com a concentração de progesterona em todos os seis fenótipos visuais existentes (r543= 0,37; p= 0,00; r556= 0,39, p= 0,00; r562= 0,39, p= 0,00; r543/556= 0,39, p= 0,00; r543/562= 0,40, p= 0,00; r556/562= 0,39, p= 0,00). Os valores de JND variaram de 0,05 a 4,63, sendo 1 o valor crítico que define a diferença cromática como sendo perceptível.

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Tricromatas apresentaram maiores valores de JND no geral (63,3% das vezes), no entanto em nenhuma situação o JND para tricromatas superou o de dicromatas em mais de 1 JND. As situações em que os valores de JND de um fenótipo dicromata foram maiores que os valores encontrados para um tricromata só ocorreram quando o fenótipo dicromata apresentava o pigmento M/L com absorção máxima por volta de 562 nm (Tabela 3). O fenótipo tricromata que mais vezes superou a detecção do sinal de dicromatas foi o 556/562 (Tabela 3).

Tabela 3. Comparação de sinais cromáticos, JND, entre diferentes tipos de fenótipos de visão de cores. Cada célula representa a porcentagem de ocasiões em que o sinal do fenótipo da coluna excede o da linha.

543 556 562 543/556 543/562 556/562 543 100 100 100 100 100 556 0 100 11 100 100 562 0 0 2 17 41 543/556 0 89 98 100 98 543/562 0 0 83 0 77 556/562 0 0 59 2 23 Dicromatas Tricromatas DISCUSSÃO

Esse estudo mostra que existe variação de coloração na pele de fêmeas detectável ainda não descrita para primatas do Novo Mundo e que essa variação ao longo do ciclo reprodutivo se correlaciona com os níveis de progesterona. A coloração da genitália foi a que se mostrou melhor correlacionada às variações de progesterona, com os maiores coeficientes de correlação (valor máximo de r = -0,57) ocorrendo para o eixo azul-amarelo. Tanto o eixo azul-amarelo quanto o eixo verde-vermelho são capazes de perceber a variação de cor na genitália devido à progesterona. Essa associação da coloração com níveis de progesterona ocorre também em primatas do Velho Mundo

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(Dixson, 1998), apesar de não se ter encontrado, com métodos mais precisos, relação com hormônios sexuais (Higham et al., 2008). No entanto, o fato do eixo azul-amarelo ter se mostrado o mais sensível à variação torna esse sinal distinto dos outros sinais já averiguados em primatas.

A variação da coloração na face dos animais se mostrou correlacionada com o eixo azul-amarelo e verde-vermelho, sendo este último eixo mais ajustado a essa variação. Já para a barriga, tanto dicromatas quanto tricromatas apresentaram o azul- amarelo como eixo mais fortemente adaptado à variação da concentração de progesterona, apesar de o eixo verde-vermelho também mostrar correlação com o hormônio. Setchell et al. (2006) mostraram que fêmeas de mandril passam por mudanças no tom de vermelho da face durante o ciclo ovulatório. Com nosso resultado verifica-se que, em sagüi comum, não é vantajosa a existência de dois cones M/L para a percepção da variação de cor na pele nua, como é sugerido em outros estudos (Changizi

et al.,2006). Em alguns casos, a inclusão de um segundo cone M/L (que possui pico de

absorção espectral entre 500 e 700 nm) pode tornar a detecção desse sinal menos precisa (Tabela 2).

Não houve diferença entre a percepção do sinal entre o sistema visual tricromata e o dicromata, já que em nenhuma situação modelada a diferença dos valores de JND entre os fenótipos ultrapassou 1 (uma) unidade. Porém, mesmo sem uma diferença de detecção, houve um padrão nas diferenças perceptuais entre os fenótipos apontando, respectivamente, os fenótipos que melhor e pior perceberam o sinal como sendo o 562 dicromata e o 556/562 tricromata e o 543 dicromata e o 543/556 tricromata. Com essa diferença de percepção entre os fenótipos se espera que o alelo mais freqüente na população seja o 562 se a detecção desse sinal confere vantagem na sobrevivência ou

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reprodução dos animais. Esse alelo é, de fato, o mais freqüente em populações de calitriquídeos (Rowe & Jacobs, 2004)

Já foi sugerido para sinais cromáticos de frutos que o melhor fenótipo dicromata parece ser o que possui comprimento de onda M/L mais longo e o melhor tricromata é o com os cones M/L mais distantes (Summer & Mollon, 2000a; Osório et al., 2004; Perini

et al., 2009). De acordo com Summer e Mollon (2000a e 2000b), a separação dos

pigmentos é benéfica porque permite cobrir uma maior faixa no espectro de luz, detectando maior quantidade de itens, e pigmentos mais longos parecem ser melhores para detectar maturidade de frutos. Na verdade, parece que a importância de se ter uma captação na faixa mais longa do espectro sobrepuja a importância de se ter pigmentos com valores de absorção máxima mais distantes (Perini et al., 2009), o que está de acordo com os achados do presente estudo.

Comparação entre primatas do Velho e do Novo Mundo

Nosso estudo mostrou que a ativação do eixo azul-amarelo captando a luz refletida da genitália de um macaco do Novo Mundo varia em correlação negativa com a concentração de progesterona, mas a do eixo verde-vermelho está correlacionada positivamente. Isso significa que quando a concentração de progesterona é baixa, estado em que se encontra esse hormônio no momento da ovulação, a ativação no eixo azul- amarelo tende a ser alta enquanto que no eixo verde-vermelho é baixa. Em termos perceptuais a coloração tende a ficar mais azul esverdeada ou menos vermelho- amarelada quando o animal está no momento provável da ovulação.

Como são raros os estudos com espectrofotometria utilizando a cor da genitália fica difícil a realização de comparações, porém estudos anteriores denominam de “mais vermelha” a cor do clímax de inchaço sexual (Dixson, 1998; Waitt et al., 2006) ou a cor

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da face nos dias antes da ovulação (Setchell et al., 2006). Nesse sentido, a variação dessa cor em macacos do Novo Mundo é diferente da encontrada em primatas do Velho Mundo, porque ocorre em uma faixa de comprimentos de onda diferente. Essa modificação faz sentido devido ao fato dos machos de primatas do Novo Mundo, que são dicromatas, não possuírem o eixo verde-vermelho e, portanto não conseguirem perceber claramente variações na faixa do vermelho.

O sinal presente em animais do Velho Mundo é exagerado e custoso devido à forte competição existente entre animais que vivem em sistemas sociais gregários (Nunn, 1999). No entanto, o sinal não precisa ser custoso em um ambiente com baixa competição por parceiros sexuais. Em um modelo de estratégia evolutivamente estável, Pagel (1994) mostrou que o esforço na escolha de parceiros aumenta conforme aumenta o número de competidores e é muito baixo quando o animal é o único reprodutor. Sagüis vivem em um sistema social em que um casal geralmente monopoliza a reprodução no grupo. Além disso, os animais podem estar tendo um custo ainda menor utilizando múltiplos sinais (também o olfativo: Ziegler et al., 1993 e Washabaugh & Snowdon, 1998; e comportamental Kendrick & Dixson, 1983) para sinalizar fertilidade e facilitar a escolha de parceiro (Candolin, 2003).

Sinalização de gravidez

Um momento da vida da fêmea que exibe mudanças marcantes na concentração de progesterona é a gravidez. Durante os 144 dias (aproximadamente 21 semanas) de gestação o sagüi exibe, nas 12 primeiras semanas, níveis de progesterona dez vezes mais elevados que o valor basal encontrado no ciclo ovulatório e, a partir da 13a semana, os níveis são ainda mais altos, chegando a quatro vezes os níveis das primeiras semanas de gestação (Hearn, 1983). Como a concentração de progesterona varia em conjunto

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com a coloração da pele das fêmeas, durante a gravidez a variação na coloração deve ser bem notável.

Em C. jacchus os machos aumentam a freqüência de comportamentos afiliativos