4.1 Material botânico
Foi realizada uma saída de campo em março de 2005 e teve como destino a cidade de Mineiros localizada no Estado de Goiás. Nesta saída foram amostrados 3 indivíduos de 3 populações diferentes da espécie Filgueirasia arenicola. Dois indivíduos de duas populações foram amostrados na rodovia entre a cidade de Jataí e Mineiros e o terceiro indivíduo foi coletado no Parque Nacional das Emas.
Os indivíduos amostrados entre a cidade de Jataí e Mineiros (ao lado da BR-364) foram chamadas de “P1” e “P2”, nas coordenadas geográficas 17º.40´02´´.4´´S- 52º.15´46.6´´W e 17º.40´12´´.8´´S e 52º.14´57´´.6´´W, respectivamente. O terceiro indivíduo foi chamado de “PNE” coletado no Parque Nacional das Emas com coordenada geográfica 17º.59´49.0´´S e 52º.56´18.5´´W.
Os materiais de F. arenicola foram herborizados e posteriormente incluídos nos herbários da Universidade de Brasília (UB) e do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) do Distrito Federal, Brasil.
As espécies foram identificadas pelo Dr. Tarciso S. Filgueiras, especialista na família Poaceae. As informações morfológicas foram baseadas na Obra Príncipe (McClure, 1973) e no trabalho de Guala (1995).
4.2 Técnicas histológicas
Para a análise histológica foram coletados folhas e colmos do penúltimo entrenó no sentido acrópeto; além desses, foram coletados também raízes e rizomas de três indivíduos em cada localidade. Para posteriores estudos anatômicos, o material vegetal foi armazenado em álcool 70ºGL (Jensen, 1962). Foram realizadas secções anatômicas transversais nos três indivíduos, sendo confeccionadas 30 lâminas à mão-livre e 30 em micrótomo rotatório. Para a análise da epiderme em vista paradérmica, foi adotado o mesmo padrão de quantidade de lâminas. Posteriormente, as lâminas foram fotomicrografadas no microscópio Olympus CX 31 com câmera digital Olympus Camedia C7070 Wide Zoom.
Para as descrições anatômicas adotou-se a terminologia de Metcalfe (1960) e de Ellis (1976 e 1979).
Os procedimentos para estudos em microscopia óptica foram realizados no Laboratório de Anatomia Vegetal da UnB.
Para padronização do estudo, a epiderme em vista paradérmica foi seccionada em pequenos retângulos da região mediana foliar, ao passo que para os cortes em secção transversal da lâmina foliar, bainha foliar, colmo, raiz e rizoma adotou-se a região mediana. Para a obtenção da epiderme em vista paradérmica, os cortes foram colocados na solução de Franklin, permanecendo por 15 dias em estufa a 40ºC (Franklin, 1945). Os fragmentos obtidos foram corados com 2 corantes aquosos: Azul de metileno com bórax ou Safranina 1%. Os cortes foram montados em glicerina 50% entre lâminas e lamínulas e lutados com esmalte (Purvis, Collier & Walls, 1964).
Para obtenção do macerado da folha, bainha e colmo utilizou-se a solução de Franklin por volta de 15 dias em estufa a 40ºC (Franklin, 1945). Em seguida foram corados com corante aquoso Safranina 1%. Os cortes foram montados em glicerina 50% entre lâminas e lamínulas e lutadas com esmalte (Purvis, Collier & Walls, 1964).
Com a finalidade de obtenção dos cortes transversais à mão-livre da lâmina foliar, bainha, raiz e colmo, o material foi colocado em glicerina 50% e fervido por 5 minutos. O colmo foi autoclavado por 4 horas diárias durante 5 dias para então ser seccionado a mão- livre. Em seguida, os cortes foram clarificados em hipoclorito de sódio a 30% com 2% de cloro ativo por no mínimo 2 dias.
Os cortes foram lavados em água destilada e corados com Azul de alcian e Safranina alcoólica 1% na proporção 6/1. Logo após a coloração, os cortes foram submetidos à série alcoólica crescente (Johansen, 1940). Feito isto, os cortes foram montados entre lâminas e lamínulas usando como meio de montagem resina sintética (Paiva et al., 2006).
Para os testes histoquímicos foram utilizados os seguintes reagentes específicos: lugol, para a identificação do amido (Johansen, 1940); floroglucinol acidificado, para a identificação de lignina (Johansen, 1940); sudan IV, para identificação da cera (Johansen, 1940), suberina e cutina (Sass, 1951) e cloreto férrico 10%, para a identificação de substâncias fenólicas (Johansen, 1940). Os cortes foram montados em glicerina 50% entre lâminas e lamínulas e lutadas em esmalte (Purvis, Collier & Walls, 1964).
Para obter os cortes transversais de raiz, colmo e rizoma em micrótomo rotatório, os mesmos foram colocados em frascos- contendo água destilada e glicerina comercial, sendo os mesmos posteriormente submetidos à pressão na autoclave por 4 horas diárias durante uma semana.
Para obtenção das lâminas permanentes utilizou-se o processo de desidratação em série alcoólica (Johansen, 1940). O material foi incluído em parafina e, posteriormente, (antes da secção), os blocos foram colocados em placa de petri contendo solução de ácido fluorídrico 5% por cerca de 3 dias. Em seguida foram seccionados com espessura de 15 micrômetros (µm) no micrótomo Leica com navalha de aço. Posteriormente, os cortes passaram por uma bateria de coloração, no qual foram usados os corantes alcoólicos Safranina e Fast Green 1% (Johansen, 1940). Logo após a coloração os cortes foram montados entre lâminas e lamínulas usando como meio de montagem resina sintética (Paiva et al., 2006).
Para o estudo em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) utilizou-se o aparelho JEOL JSM 840-A do Laboratório de Microscopia Eletrônica da UnB, com fotografias registradas em filme Neopan SS (Fuji) usando a metodologia de Guala (1995) com modificações.
A análise anatômica quantitativa da folha, caule e da densidade estomática em um campo de 1mm2 foi efetuada a partir de fotografias digitais obtidas em máquina Olympus acoplada ao microscópio óptico Olympus, a partir de 30 medições em vista paradérmica, macerado e secções transversais. Utilizou-se programa analisador Image Pro-Plus versão
4.5.122 para Windows para realizar as mensurações, no Laboratório de Produtos Florestais do IBAMA de Brasília/DF. Os valores determinados estão expressos em valores médios acompanhados dos respectivos desvios-padrão, números mínimos e máximos. As células silicificadas quadrangulares não foram analisadas anatomicamente já que foram identificadas posteriormente e os microtricomas na superfície adaxial não se apresentaram em quantidade suficiente.
Para o estudo morfométrico, foram mensurados, com auxílio de trena e paquímetro, altura total, altura da primeira ramificação, comprimento do ramo, comprimento do entrenó acima e abaixo da primeira ramificação, diâmetro do entrenó acima e abaixo da primeira ramificação, diâmetro do nó na inserção da primeira ramificação, diâmetro do nó acima e abaixo da primeira ramificação, diâmetro da medula, espessura do córtex, comprimento e largura da folha e comprimento e largura da bainha. A quantidade de entrenós e o número de folhas da primeira ramificação foram contados manualmente.
Foram utilizadas 30 repetições para os dados morfológicos, e as médias submetidas à análise de variância, com comparação de teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Para comparar as medidas externas entre as diferentes localidades foi utilizado o teste de correlações [Coeficiente de Correlação Linear de Pearson (r)], seguido de análise fatorial, análise de componentes principais e análise de conglomerados (cluster). As medidas de largura da bainha foliar não foram utilizadas por não apresentarem diferenças. Em anexo seguem os dados e as análises estatísticas detalhadas utilizadas para os dados anatômicos e morfológicos.
As lâminas produzidas estão depositadas no laminário do laboratório de Anatomia vegetal do Departamento de Botânica da Universidade de Brasília (UnB).