MATERIAL E METODOS

Foram utilizados camarões marinhos da espécie Litopenaeus vannamei com 6±1,3g provenientes do Laboratório de Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina. A cepa de bactéria ácido láctica Lactobacillus plantarum foi utilizada como probiótico. Esta bactéria foi isolada dos camarões cultivados (Vieira et al., 2007) e mantida na coleção de microorganismos do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) sob o número de acesso CPQBA 007-07 DRM01. O prebiótico utilizado foi inulina da marca comercial Orafti® HPX.

3.4.2 Condições experimentais

Foram utilizados 16 tanques de 10.000L povoados com 200 camarões em delineamento totalmente ao acaso, com quatro tratamentos em quadruplicata. Durante seis semanas animais de cada tanque foram alimentado com uma dieta experimental contendo: i) ração comercial suplementada com 0,5% inulina, ii) ração comercial suplementada com 107 UFC/g de Lactobacillus plantarum, iii) ração comercial

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suplementada com 0,5% de inulina + 107 UFC/g de Lactobacillus plantarum, iv) ração controle (sem suplementação). Os probióticos foram incluídos na dieta de acordo com a metodologia descrita por Vieira et al. (2008) inoculando 10% do oncent da bactéria láctica na ração. Na inclusão do prebiótico, a dieta comercial foi previamente moída e adicionada a oncentração de 0,50% de inulina para homogeneização. Depois de homogeneizadas, as misturas passaram por um processo de peletização e secagem por 18h a 450C com circulação de ar. Para a preparação do simbiótico, foi incluído o 10% do probiótico na ração com inulina 0,5%.

A ração foi fornecida quatro vezes ao dia em uma quantidade equivalente a 3% de biomassa, sendo ajustada semanalmente de acordo com as biometrias (15 animais por tanque). A temperatura da água foi mantida em 26 ± 1°C e a salinidade em 30ppm. A água dos tanques foi renovada todos os dias até retirar os restos de alimento, fezes e mudas. O Ph e amônia dos tanques também foram mensurados uma vez por semana para moitorar a qualidade da água.

3.4.3 Análise da microbiota do trato intestinal

Foram amostrados tratos digestivos de 10 camarões por tanque (dois pools de cinco camarões) após 30 e 45 dias. O tratos intestinais foram homogeneizados em um gral e diluídos serialmente (1/10) em solução salina estéril 3% (SSE) e semeados em meio de cultura Agar Marinho, Agar tiossulfato citrato bile sacarose (TCBS) e Agar MRS para contagem de bactérias heterotróficas viáveis, vibrionáceas e bactérias lácticas respectivamente. Os intestinos semeados nas placas de Petri foram incubados em estufa e a temperatura foi mantida em 30°C.

Posteriormente, foram efetuadas contagens totais de unidades formadoras de colônias (UFC) após 24 horas de incubação nos meios de cultura Agar Marine e Agar TCBS. No meio Agar MRS as contagens foram feitas após 48 horas. Das colônias crescidas em MRS, foi feita a coloração de Gram para comparação morfológica da cepa probiótica. 3.4.4 Análises imunológicas

A hemolinfa foi obtida do sinus ventral de dois pools de cinco camarões de cada tanque (cerca de 300 uL por animal). As amostras foram coletadas com seringas estéreis de 1 mL de agulha 21G resfriadas a 4°C.

Da hemolinfa coletada, 10 uL foram fixados em solução anticoagulante Alsever modificado (MAS) (citrato de sódio 27mM,

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EDTA 9mM, glicose 115mM, NaCl 336mM, pH 7,2) com 4% de formaldeído para contagem total de hemócitos (THC). O restante foi deixado coagular a 4°C e posteriormente foi centrifugado repetidamente a 10.000 x g por 10 minutos para obtenção do soro que foi aliquotado e estocado a -20°C.

O número de hemócitos por mililitro de hemolinfa foi estimado por contagem direta em câmara de Neubauer.

A concentração de proteína na hemolinfa foi estimada pelo método de Bradford (1976), utilizando soro-albumina bovina como padrão.

A atividade da PO foi determinada por espectrofotometria (490nm) pela formação do pigmento DOPA-cromo, após a oxidação do substrato L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). As amostras do soro foram diluídas (1:9) em TBS-1 (1mM Tris, 336mM NaCl, 5mM CaCl2, 10mM MgCl2, pH 7.6). Desta solução, 50 uL foram incubados em um volume igual de tripsina (Sigma, 1mg/mL), indutor enzimático em microplacas de 96 poços (fundo chato) por 5 min a 25°C. Após incubação, foi adicionado um volume de 50 µL de L-DOPA (Sigma, 3mg/mL) em cada poço. Nos controles, o soro ou a tripsina foram substituídos por TBS-1. A formação do DOPA-cromo foi monitorada em Leitora de Microplaca (490 nm) após 5, 10, 15 e 20 min. A atividade da PO foi expressa em unidades de atividade da enzima (U) através da variação de 0,001 na absorbância/minuto/miligrama de proteína (Söderhäll & all, 1984) por 15 minutos a 20°C. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Para a atividade aglutinante do soro, se utilizaram o V. alginolyticus e L. plantarum inativados com 0,5% de formalina e ajustados a uma concentração de 0.4nm em um comprimento de onda de 550nm. Amostras de 50uL de soro foram diluídas serialmente em TBS-2 (50mM Tris, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 5mM MgCl2, pH 7.4) em placas de 96 micro-poços com fundo côncavo. A cada amostra de soro foram adicionados 50uL de bactéria inativada para avaliar a capacidade aglutinante frente a cada bactéria (V. alginolyticus e L. plantarum). As amostras foram incubadas durante 18h a 25°C em câmara úmida. O controle foi feito substituindo o soro por TBS-2. O valor aglutinante foi definido como o recíproco da última diluição que teve a capacidade de aglutinar as bactérias inativadas.

Para determinar a atividade antimicrobiana do soro o V. alginolyticus com 24 horas de crescimento teve sua concentração ajustada a 103 UFC/mL em leitor de microplaca (densidade óptica de 630 nm) diluindo em meio PWS (peptone water saline) com 1,5% de peptona e 1,5% de NaCl, pH 7,4. Em placas de 96 micro-poços (fundo

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chato), amostras de 100 µL de meio PWS foram colocados em todos os poços das linhas utilizadas da microplaca. Posteriormente 100 µL de amostra do soro foram adicionados no primeiro poço e diluídos serialmente. A cada poço foram colocados 20 µL da solução diluída de V. alginolyticus. As placas foram incubadas por 24h a 30°C. Para os controles, as amostras de soro foram substituídas por SSE (2%). A DO das amostras foi feita a 630 nm e os resultados foram expressos por miligramas de proteína.

3.4.5 Infecção experimental

Depois de seis semanas de alimentação, 15 camarões de cada tanque foram transferidos para caixas de 40L de água (30ppm). Cada camarão foi injetado no sinus ventral com 25uL de V. alginolyticus diluído em solução salina a uma concentração de 108 UFC/mL e o grupo controle foi injetado com 25 uL de SSE. A sobrevivência foi avaliada 48h após a infecção. Posteriormente, cinco camarões de cada tanque (um pool de cinco camarões) foram retirados para coleta de hemolinfa para análises dos parâmetros imunológicos (THC, atividade da PO, título aglutinante do soro e atividade antimicrobiana do soro).

3.4.6 Análises Estatísticas

Os valores das contagens totais de hemócitos e contagens bacterianas foram transformados para log(x+1) para normalização e homogeneização das variâncias. Os valores da atividade antimicrobiana e atividade aglutinante do soro foram transformados para log2(x) e os de sobrevivência em arcoseno(x). Foi utilizada análise de variância com parcelas subdivididas no tempo (α<0,05) para os dados obtidos durante a engorda experimental. Para os dados obtidos após o desafio experimental foi utilizada análise de variância unifatorial (α<0,05). Em caso de diferenças significativas, foi utilizado o teste Student Newman Keuls (SNK) de separação de médias (Zar, 1984).