Material E Métodos

2.2.1 Criação de Diaphorina citri

A criação foi iniciada utilizando adultos de D. citri fornecidos pelo Laboratório de Biologia de Insetos situado no campus da ESALQ-USP em Piracicaba-SP. A criação foi mantida em sala climatizada com temperatura de 25 ± 2 °C; 65-80% de UR e 12 h de fotofase e também em estufas em condições climáticas não controladas, de forma semelhante à descrita por Conceschi (2013). A técnica de criação de D. citri utilizada foi semelhante à metodologia descrita por Gómez-Torres (2009).

2.2.2 Produção do fungo entomopatogênico Isaria fumosorosea ESALQ 1296 e preparo das suspensões fúngicas

O isolado Isaria fumosorosea ESALQ-1296 foi obtido de Bemisia tabaci na região de Jaboticabal-SP e esta disponível no banco de entomopatógenos do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos, ESALQ-USP, Piracicaba-SP, armazenados em criotubos dentro de freezer (-80 oC). O fungo foi cultivado em placas de Petri de vidro de 9 cm de diâmetro previamente esterilizadas, contendo meio Sabouraud Dextrose enriquecido com extrato de levedura (SDYA: 2,5 g.L-1 de peptona bacteriológica, 10 g.L-1 de dextrose, 2,5 g.L- 1

de extrato de levedura, 15 g.L-1 de ágar) previamente autoclavado a 120 oC por 20 minutos. O inóculo foi espalhado com auxílio de uma alça de Drigalsky e as placas mantidas em câmara climatizada do tipo B.O.D. (Biological Oxigen Demand), a 26 ± 1 °C e 14 horas de fotofase por 10 dias.

A produção de conídios aéreos foi feita em sacos de polipropileno contendo 300 g de arroz parboilizado tipo 1, previamente cozido e esterilizado por autoclavagem a 120 ºC por 20 minutos. Os sacos foram inoculados com 10 mL de uma suspensão de 1 x 107 conídios.mL-1 de I. fumosorosea ESALQ-1296 produzidos em placas e agitados vigorosamente para obter uma distribuição uniforme dos propágulos no substrato. As sacolas contendo o arroz inoculado foram armazenadas em uma B.O.D. a 26 ± 1°C e 12 horas de fotofase e, após quatro dias, o arroz foi transferido para bandejas plásticas (30 × 45 × 12,5 cm) a fim de permitir a esporulação fúngica. Posteriormente, os conídios aéreos foram extraídos dos grãos de arroz por meio de um sistema vibratório contendo três peneiras de 20 cm de diâmetro com o tamanho da abertura de 32 mesh (500 µm) (BERTEL Indústria Metalúrgica Ltda., São Paulo, Brasil). Os conídios puros em forma de pó foram armazenados em freezer -20 ºC até o preparo das suspensões para os experimentos.

Para o preparo das suspensões foram misturados em água destilada estéril os conídios aéreos produzidos em arroz (lote com viabilidade superior a 95%). Três diluições em série foram feitas para possibilitar a contagem dos mesmos em câmara de Neubauer, e a concentração foi ajustada em 5 × 106 conídios viáveis.mL-1. Posteriormente, foram adicionados os adjuvantes Tween 80 na concentração de 0,01% (v/v) (Monooleato de Sorbitan 80, Oxiteno®, Brasil), KBRAdj na concentração de 0,075% (v/v) (em pedido de registro pela Koppert Sistemas Biológicos LTDA, Piracicaba, SP, Brasil) e Silwet L-77 na concentração de 0,025% (v/v) (Copolímero de poliéter e silicone 1000 g.L-1, Momentive

Performance Materials Industria de Silicones LTDA®, Brasil), concentrações estas utilizadas por Conceschi, 2013.

2.2.3 Pulverizações e preparação de Diaphorina citri para a observação no microscópio eletrônico de varredura

Os estudos tiveram a colaboração da pesquisadora Dra. Maria Izabel Camargo Mathias, docente e responsável pelo Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Biologia da UNESP – Rio Claro e do Pós-doutorando Dr. André Arnosti. Os tratamentos foram preparados no laboratório de Patologia e Controle microbiano da ESALQ-USP através da mistura do fungo I. fumosorosea ESALQ-1296 (If) na concentração de 5 x 106 conídios.mL-1 com o adjuvante Tween 80, KBRAdj e Silwet L-77, sendo: 1- Tween 80 0,01%, 2- KBRAdj 0,075%, 3- Silwet L-77 0,025%, 4- If + Tween 80 0,01%, 5- If + KBRAdj 0,075%, 6- If + Silwet L-77 0,025%. O tratamento com o Tween 80 foi utilizado como controle porque é um espalhante adesivo amplamente utilizado na preparação de suspensões fúngicas.

A pulverização dos tratamentos foi realizada sobre ninfas e adultos de D. citri. Antes da pulverização, folhas jovens de limão cravo (Citrus limonia) foram infestadas com ninfas de 1º e 3º instares e acondicionadas em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. Para os ensaios com adultos, foi necessário anestesiar os mesmos com CO2 por período de 30 segundos, a fim de evitar a fuga durante a pulverização. Os insetos anestesiados foram colocados em placas de Petri de vidro de 9 cm de diâmetro contendo papel filtro no fundo. A pulverização foi realizada em uma Torre de Potter (Burkard Manufacturing Company Limited), sob pressão de 15 PSI e um volume de 2 mL por repetição. O número total de ninfas de cada estádio e adultos pulverizados foi de 80 indivíduos dispostos em quatro repetições (20 insetos/cada). Posteriormente, as ninfas tratadas foram mantidas nas folhas de limão cravo e os adultos foram confinados em uma planta de limão cravo de aproximadamente 20 cm de altura colocada dentro de um copo plástico (dimensões de 13,5 cm x 8,5 cm x 5,5 cm e o volume de 500 mL) contendo tecido voile com velcro (CONCESCHI, 2013). Todos os insetos tratados foram mantidos em sala climatizada 25 ± 2 °C, 70 ± 20 % de UR e 12 h de fotofase, por 24, 48, 72 horas. Em cada tempo, foram retirados 15 insetos e transferidos para tubos de Eppendorf contendo uma solução fixadora de Paraformaldeído a 4% e mantidos por 24 horas em geladeira. Após a fixação dos insetos, foi realizada a desidratação dos mesmos pela

passagem sucessiva de soluções de acetona (70%, 80%, 90%, 95% e duas vezes em 100%, com duração de 10 minutos cada banho). Os insetos foram colocados para secagem em ponto crítico, e posteriormente, foram colados em stubs de alumínio com fitas dupla-face, a fim de serem metalizados com banho de ouro em sputtering. Os insetos foram examinados e fotografados em microscópio eletrônico de varredura Hitachi TM3000, do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Biologia da UNESP – Rio Claro.

2.2.4 Avaliação da deposição de conídios de Isaria fumosorosea sobre Diaphorina citri Com o objetivo de avaliar a deposição de conídios de Isaria fumosorosea sobre as ninfas e adultos de Diaphorina citri, foram realizadas as pulverizações dos tratamentos descritos previamente no item 2.2.3. Dez indivíduos foram pulverizados por repetição (n=3 repetições) na concentração de 5 × 106 conídios.mL-1, totalizando 30 insetos por tratamento. Os experimentos foram repetidos duas vezes no tempo e os dados foram analisados conjuntamente por não apresentar diferenças entre os experimentos. Após a pulverização e secagam dos tratamentos no corpo dos insetos, cada repetição de 10 indivíduos foi transferida para tubos de Eppendorf de 1,5 mL contendo 1 mL de água destilada estéril. Os tubos foram agitados em Vortex® por 2 minutos para facilitar a remoção dos conídios aderidos ao corpo dos insetos. De cada tubo foram retirados 100 µL e inoculados em placas de 9 cm de diâmetro contendo meio de cultura BDA seletivo descrito por Behie, Jones e Bidochka (2015). Todas as placas foram mantidas em B.O.D. a 26 ± 1 °C e 14 horas de fotofase por quatro dias para quantificar o número de unidade formadora de colônia (UFC) e assim determinar o número de conídios depositado nos insetos. Os dados de UFC foram submetidos ao teste de Tukey a 5% de significância com auxilio do pacote laercio (SILVA, 2010) do software R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2013).