Extração de Proteínas
As sementes de gergelim branco (Sesamum indicum L.), foram trituradas e submetidas à extração através de trituração em solução extratora contendo NaCl 0,6 M e HCl 0,1%, em proporção de 1:4 (massa/volume), permanecendo em refrigeração (4ºC) durante 6 horas. O extrato bruto foi centrifugado por 90 minutos, a 4.000 RPM e 4ºC, tendo sido o precipitado descartado. Em seguida, as proteínas presentes no sobrenadante foram precipitadas com (NH4)2SO4 a 100% de saturação, com constante agitação, durante 12 a 24 horas. Seguiu-se nova centrifugação, nas condições descritas anteriormente, por 45 minutos, tendo sido o precipitado dialisado 24 horas contra água destilada (3.0 kDa cut off). O material resultante foi então centrifugado a 3.500 RPM, por 15 minutos. O sobrenadante foi liofilizado, constituindo a fração rica em proteínas (FRP).
Isolamen to de albuminas 2S de sementes de S . indicu m
A fração rica foi aplicada em duas colunas distintas, Red-Sepharose CL- 6B e Blue-Sepharose CL-6B, ambas com afinidade a moléculas catiônicas e hidróficas, porém com ligantes diferentes (Procion Red HE-3B e Cibacron Blue F3G-A, respectivamente), visando escolher a mais eficiente para separação de proteínas com essas características. A coluna Red-Sepharose CL-6B foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0,
contendo CaCl2 0,05 M, sendo as proteínas não retidas (PNR) eluídas com o tampão de equilíbrio, enquanto as proteínas retidas (PR) foram liberadas com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0, contendo NaCl 3 M. Em paralelo, a coluna Blue-Sepharose CL-6B foi equilibrada com tampão fosfato 0,02 M, pH 7,2, o qual foi utilizado para lavagem do pico não retido, tendo sido o pico retido eluído com o mesmo tampão acrescido de NaCl 2 M. A eluição protéica foi monitorada em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 280 nm. O fluxo aplicado na eluição foi de 0,25 mL.min- 1, sendo o volume das frações coletadas de 2 mL.
Após nova diálise (3.0 kDa cut off) e liofilização dos picos, os mesmo foram avaliados quanto a sua atividade antimicrobiana. Em seguida, 1,0 mg dos picos ativos foi ressuspendido em solução do pareador iônico ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e aplicados em uma coluna analítica de HPLC de fase-reversa (Vydac C-18TP 522). Primeiramente, a fração retida foi eluída usando gradiente linear de acetonitrila (0-100%) e fluxo de 1,0 mL.min- 1. Entretanto, visando uma melhor separação dos picos protéicos eluídos na faixa entre 20-50% de acetonitrila, passou-se a utilizar gradiente não linear de acetonitrila (5 a 0%; 5 de 0-20%; 35 de 20-50%; 10 de 50-70%; 5 70- 100%).
An álises de massa molecular por SDS-PAG E
As frações protéicas foram analisadas por SDS-PAGE, a 12 e 15%, de acordo com Laemmli (1970), com menores modificações. Para tanto, alíquotas
de 30 g de proteína foram previamente precipitadas com ácido tricloacético (TCA) 75%, na proporção de 133 L de TCA 75% para cada de 1,0 mL de amostra, durante 30 minutos em repouso, a 15 C. Em seguidas, as amostras foram centrifugadas, por 15 minutos a 13.400 RPM, e o sobrenadante descartado. Os precipitados foram lavados com 1,0 mL de acetona gelada e novamente centrifugados por 15 minutos a 13.400 RPM. Em seguida, as amostras foram ressuspendidas em 20 L de tampão de amostra, contendo Tris-HCl 20 mM pH 6,8, SDS 0,2%, azul de bromofenol 0,04%, glicerol 10% e -mercaptoetanol 0,04%, e fervidas durante 10 minutos. A corrida foi feita a 200 V e 20 mA, por aproximadamente 2 horas. Os géis foram corados com prata.
An álises de massa molecular por espectrometria de massa
Os picos obtidos do HPLC foram liofilizados e submetidos à análise de espectrometria de massa por Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Analysis (MALDI-ToF) em um Voyager-DE STR Bioworkstation. As amostras foram dissolvidas em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e foi adicionado ácido sinapínico (uma solução saturada dissolvida em acetonitrila/TFA 0,1% 1:1 v/v). A solução foi, então, homogeneizada em vortex e alíquotas de 1,0 mL foram aplicadas no Voyager Bioworkstation. As amostras foram secas à temperatura ambiente. O espectrômetro foi operado em modo linear. Os íons das amostras foram eliminados por irradiação com um laser N2 em comprimento de onda de 337 nm, e acelerado a um potencial de 23 kV na fonte do íon com um atraso de 150 ns. As amostras foram, então, ionizadas
com 100-200 tiros em um pulso de laser de 3 ns. O sinal foi digitalizado a uma fração de 500 MHz e os dados avaliados foram mostrados em um sistema de dados padrão do Voyager para manipulação.
Seqü enciamen to de S i-AMP
As amostras provenientes de HPLC foram liofilizadas objetivando remoção de acetonitrila e TFA. A seqüência N-terminal parcial do peptídeo foi determinada usando o método de degradação de Edman (Edman, 1970), o qual utiliza a reação seletiva de N-terminal com isotiocianato de fenila. Entretanto, para determinar a seqüência completa do peptídeo, buscou-se realizar análise por MS. Para tanto, a amostra foi submetida a reações de redução e alquilação, através de adições consecutivas de DTT 100 mM, permanecendo a 60 C por 1 hora, e iodoacetamida 500 mM, por 1 hora na ausência de luz, ambos na proporção de 10% do volume da amostra. A reação foi interrompida com a adição de DTT 100 mM, na proporção 1:1. Em seguida, para digestão das proteínas, foi adicionado 100 µ L de bicarbonato de amônio 200 mM e as amostras foram incubadas com tripsina (Promega) 20 µ g.mL- 1 em acetonitrila, por 4-16 horas, a 37º C. A solução resultante foi purificada em uma coluna ZipTip, para remoção dos resíduos dos produtos e sub-produtos gerados. As frações liofilizadas foram dissolvidas em água milliQ, misturadas em uma solução saturada de uma matriz constituída por ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (1:3), depositada em uma placa do tipo Anchorchip com 600 mm e secas a temperatura ambiente. Os compostos que tiveram suas massas moleculares exatas determinadas, utilizando um
espectrômetro de massa MALDI-ToF/ToF Applied Biosystems 4700 e o software 4000 Series Explorer, foram devidamente seqüenciados. Os espectros foram obtidos com 3.000 nm de intensidade de laser e 3.000 disparos, tolerância de 0,5 m/z. Os íons protéicos gerados por autólise da tripsina foram usados como padrões internos para calibração do espectro de massa. Íons que apresentaram relação sinal-ruído apropriada foram submetidos à fragmentação (MS/MS). Os espectros foram analisados com o auxílio dos programas Protein Prospector e Pepseq.
An álises in silico
A seqüência de aminoácido obtida foi comparada com outras proteínas depositadas no NCBI Protein Data Bank (www.ncbi.nih.gov), utilizando o programa Blastp (Chen et al., 1998). As seqüências protéicas foram submetidas a um alinhamento usando o programa ClustalW (Thompson, 1994).
Preparação das bactérias patogên icas
Foram utilizadas nos ensaios de atividade in vitro as bactérias patogênicas humanas Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., E. coli, Streptococcus pyogenes e S. aureus, assim como, contra as bactérias fitopatogênicas Xanthomonas sp., Bacillus subtilis, Erwinia sp. e Rathayibacter sp..previamente replicadas e m me io Luria Bertani (LB) (10
g.L- 1 de NaCl, 5 g.L- 1 de extrato de levedura e 45 g.L- 1 de bactopeptona, dissolvidos em água), durante 18-24 horas a 37ºC.
Bioensaio em meio sólido
Inicialmente, visando uma análise geral da atividade antibacteriana, FRP, PR e PNR eluídos da cromatografia em Red-Sepharose tiveram sua atividade avaliada em placa, em meio LB acrescido de ágar (15 g.L- 1), contra Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., E. coli, S. aureus, Xanthomonas sp., B. subtilis, Erwinia sp. e Rathayibacter sp.. A densidade ótica inicial (OD) foi de 0,12 nm, a qual corresponde a aproximadamente a 107 unidades formadoras de colônia (UFC). As amostras a serem testadas foram ressuspendidas em água destilada em concentração padrão de 10.000 µ g.mL- 1, sendo utilizadas alíquotas de 20 µ L, correspondendo a 200 µ g de proteína por ensaio. Os ensaios utilizam água destilada como controle negativo (CN) e cloranfenicol como controle positivo (CP) (34 µ L de uma solução estoque de 600 µ g.mL- 1). A inibição foi avaliada após 12-16 horas de incubação a 37 C, e a porcentagem de inibição de crescimento (PIC) foi determinada a partir da fórmula, a qual traça relações com o controle negativo:
Bioensaio em meio líqu ido
Buscando maior acurácia dos resultados, tanto o FRP, quanto os PR e PNR de ambas as colunas cromatográficas, assim como peptídeos isolados por HPLC tiveram sua atividade antibacteriana avaliada em meio LB líquido. As frações protéicas foram, então, encubadas com Klebsiella sp. e Proteus sp. em meio LB, por 4 horas, a 37ºC. A OD inicial foi de 0,05 nm, a qual corresponde a aproximadamente 5 x 106 células por mL. O volume final do ensaio foi de 1,0 mL. A evolução do crescimento bacteriano foi monitorada por espectrofotômetro a 595 nm, durante cada hora experimental. Cada experimento foi realizado em triplicata. Complementarmente, testou-se PR e PNR da cromatografia em Blue-Sepharose quanto a sua capacidade de inibição do crescimento bacteriano de S. pyogenes. Visando avaliar a atividade antibacteriana das proteínas não retidas pela coluna Red-Sepharose, o PNR, na concentração de 400 g.mL- 1., foi submetido confrontado com Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Escherichia coli, Xanthomonas sp. e Rathayibacter sp., em iguais condições.