Material vegetal
Vagens imaturas de soja, com aproximadamente 15 a 20 dias após o florescimento e com sementes de 4 a 6 mm de comprimento, foram coletadas de plantas dos cultivares CAC-1 e Spring cultivadas em casa de vegetação com fotoperíodo de 14 horas de luz e temperatura de 27°C. As vagens foram desinfestadas por imersão em etanol 70% (v/v) por dois minutos, seguidos de 20 minutos em água sanitária comercial (1% de hipoclorito de sódio) contendo três gotas/100mL de Tween 20. Após três lavagens em água destilada e estéril as sementes foram dissecadas com o auxílio de pinça e bisturi e os pares cotiledonares foram excisados. Em seguida foram transferidos para meio de indução com a face abaxial em contato com o meio MSD40 (Finer e Nagasawa, 1988), contendo sais de MS (Murashige e Skoog, 1962) meia força, vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), 100 mg/L inositol, 3 % de sacarose, 0,2 % de Gelrite, 180 µM de 2,4-D e pH 7. Os explantes foram mantidos em meio MSD40 até o tratamento pela técnica de SAAT para estudo da expressão transitória de GUS. Para transformação com gene da citrato sintase, os explantes permaneceram no meio de indução por um mês e depois foram transferidos para meio de proliferação MSD20 (sais MS, vitamina B5, 3% de sacarose, 0,2 % de Gelrite e pH5,8), conforme descrito por Wright et al. (1991).
Cepa da bactéria, plasmídio e condições de cultivos
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi usada como hospedeira para todos os plasmídos. Para estudo de expressão transitória, foi usado o plasmídio binário pCAMBIA 1301 portador dos genes htp, que confere resistência à higromicina e o gene β-glucuronidase (GUS) contendo um íntron para impedir as sua expressão na bactéria. Para transformação visando tolerância ao alumínio tóxico, foram utilizadas duas construções fornecidas pelo pesquisador Dr. Newton Portilho da Embrapa – Milho e Sorgo: a primeira com o plasmídio pCAMBIA 1303 munido com o gene CS de Daucus carota sem o peptídeo sinal de mitocôndria, isolado por RT-PCR; e a segunda com o plamídio pCAMBIA 1303 carregando o gene CS de Escherichia coli, isolado por PCR a partir do DNA genômico. O gene CS de D. carota ligava-se ao promotor
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específico de raiz ToRB7 (S45406) de tabaco e o gene CS de Escherichia coli, ligado ao promotor CaMV35S. Todas as construções continham o sítio de poliadenilação do gene de nopalina sintase (NOS). As posições relativas dos genes estão mostradas na Figura 1.
Figura 1 - Mapa das construções gênicas inseridas no plasmídio pCAMBIA 1303. Promotores CaMV35S e ToRB7; AD: CS de Dauca carota sem peptídeo sinal de mitocôndria; AE: CS de Escherichia coli; NOS: Sítio de poliadenilação NOS; E: EcoRI; B: BamHI; H: HindIII
As células de Agrobacterium foram crescidas por 14-16 horas, sob agitação de 180 rpm e temperatura de 28 0C, em meio MYA (Tepfer e Casse-Delbart, 1987) contendo os antibióticos estreptomicina (100 µg/ml) e canamicina (50 µg/ml). As bactérias foram centrifugadas a 1500 g por 10 min, lavadas duas vezes com igual volume de meio líquido MSD40 (para transformação com o gene GUS) ou com meio MSD20 (para transformação com o gene CS) e recentrifugadas nas mesmas condições acima. O precipitado foi ressuspendido em meio líquido MSD40 ou MSD20, e a densidade ótica (OD600nm) foi determinada e ajustada para 0,2.
Transformação com o gene GUS
Dez cotilédones imaturos foram colocados em tubos de vidros estéreis de 13 × 100 mm juntamente com 1 ml de suspensão de Agrobacterium. Os tubos contendo os cotilédones foram colocados no centro do sonicador (BRANSON 1210). O tempo de sonicação foi dois segundos conforme sugerido por Santarém et al. (1998). Os cotilédones imaturos permaneceram na suspensão de Agrobacterium por mais 5 minutos após a sonicação e em seguida foram transferidos para meio MSD40 suplementado ou não-suplementado com acetossiringona (100 µM), onde permaneceram durante três dias. Finalmente os cotilédones foram transferidos para o meio MSD40 suplementado com 400 mg/L de Timentin (Smithkline Beeham).
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Transformação com o gene da Citrato sintase
Dez agregados de embriões foram colocados em tubos de vidro estéreis de 13 × 100 mm, juntamente com 1 ml de suspensão de Agrobacterium. Os tubos contendo os agregados de embriões foram colocados no centro do sonicador, conforme sugerido por Trick et al. (1998). Após 5 segundos de sonicação, os agregados permaneceram por mais 5 minutos na suspensão de Agrobacterium sendo, em seguida, transferidos para meio MSD20 contendo acetosseringona 100 µM e aí permanecendo por três dias. Após o co-cultivo com Agrobacterium, os agregados foram cultivados em meio MSD20 contendo 400 mg/L de Timentin por duas semanas. Em seguida, foram transferidos para meio MSD20 contendo 400 mg/L de Timentin e 20 mg/L de higromicina. Os agregados foram transferidos semanalmente para meio recém-preparado, durante seis semanas. Após este período, os embriões foram transferidos para o meio de histodiferenciação (sais MS, vitamina B5, 6% de maltose, 0,5% de carvão ativado, 0,2% de gelrite e pH5,8) (Bailey et al., 1993), onde permaneceram por 10 dias. Finalmente, os embriões foram transferidos para o meio MSM6 (MSM6AC sem carvão ativado). As plantas foram regeneradas conforme descrito por Finer e McMullen (1991).
Ensaio histoquímico de GUS
O ensaio histoquímico foi realizado dois dias após a transferência dos cotilédones para o meio contendo 400 mg/L de Timentin. Os cotilédones foram colocados em solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-gluronídeo (X-Gluc) para ensaio de GUS de acordo com Jefferson (1987) e incubados durante a noite a 37°C, sob agitação orbital a 80 rpm. A solução de X-Gluc foi removida e os cotilédones foram lavados duas vezes com etanol 70%. A partir de fotos dos cotilédones tiradas em lupa estereoscópia (OLYMPUS SZH 10), determinou-se a atividade GUS por análise de imagem, pelo programa QUANT Versão 1.0 (Vale et al., 2001), estimando-se a percentagem de área coberta com setores azuis.
Os experimentos foram formados com seis repetições, com 10 cotilédones por repetição. Médias da percentagem da superfície coberta por setores azuis foram calculadas e comparadas pelo teste Tukey, com P= 0,01.
Confirmação das plantas transformadas com o gene CS
A confirmação das plantas transformadas com o gene CS foi baseada em PCR. Amostras de DNA das folhas foram extraídas e purificadas, seguindo a metodologia descrita por Doyle e Doyle (1990). O DNA foi quantificado em espectrofotômetro, considerando-se que uma OD260 é equivalente a, aproximadamente, 50 ng/µl de DNA fita dupla. A qualidade do DNA foi avaliada por eletroforese em géis de agarose 0,8%, corados com brometo de etídio.
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O DNA genômico das plantas transformadas foi amplificado com primers específicos. Para o gene CS de D. carota o par de “primers” utilizado foi o cenoura F (CGC AAG CTT AAA TTG AAT GTA TTT ATT) e o cenoura R (CGC GGA TCC ATG CTC GAT CTT CGT TCT). Já para o gene CS de E. Coli o par de “primers” empregado foi o ecoli F (GCG GGA TCC TTA AAT GGC TGA TAC) e o ecoli R (GCC AAG CTT AAC GCT TGA TAT CGC). Com o promotor de raiz, o par “primers” foi o raiz F (GGC GAA TTC GGT CAT ACG GTA TAT CAT) e o raiz R (GGC GCA TCC GGC AAT CCT CAC CAT TTT). Todos os “primers” foram fornecidos pelo pesquisador Newton Portilho. Cada reação de amplificação de 25 µl continha 30 ng de DNA, 0,1 mM de cada um dos deoxinucleotídios (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), MgCl2 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; KCl 50 mM; 0,5 µM de primer e uma unidade de Taq DNA polimerase.
As reações de amplificação foram efetuadas em termociclador Perkin-Elmer, (modelo 9600), de acordo com Wang et al. (1993). Os ciclos de amplificação foram constituídos de uma etapa de desnaturação a 94 oC, por 30 segundos; uma etapa de ligação do primer ao DNA molde a 50 oC, por 40 segundos; e uma etapa de extensão a 72 oC, por 90 segundos. Depois de 35 ciclos, efetuou-se uma última etapa de extensão a 72 oC, por sete minutos. Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose 1,2% contendo 0,2 µg/ml de brometo de etídio, imerso em tampão TBE (Tris-borato 90 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). As bandas de DNA foram visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas com o sistema de fotodocumentação “Eagle Eye II” (STRATAGENE).
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