As folhas de I. marcellia foram coletadas, secas à sombra, trituradas e acondicionadas em sacos de nylon para posterior fornecimento aos caprinos do experimento. O peso das folhas secas representou 40% das folhas verdes. A concentração de swainsonina e calysteginas nas folhas dessecadas de I. marcellia foi mensurada por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa como previamente descrito por Gardner et al. (2001).
No experimento foram utilizados oito caprinos machos; clinicamente sadios, com idade entre 6-9 meses e peso entre 16-21 kg. Desses animais coletou-se sangue e o soro foi destinado à dosagem de AST (aspartato aminotransferase), GDH (glutamato desidrogenase) e GGT (gamaglutamiltranspeptidase) para que se pudesse descartar doença hepática prévia. Trinta dias antes do início do experimento os caprinos receberam medicação antiparasitária, foram numerados ao acaso e mantidos em baias individuais, visando à adaptação e observação clínica. No início da manhã, recebiam ração comercial, suplemento mineral, feno de tifton (Cynodon dactylon) e água ad libitum. Após o período de adaptação os caprinos foram distribuídos em dois grupos: Grupo I, constituído pelos Caprinos 1-6 [receberam misturadas à ração I. marcellia dessecada contendo 0,02% de swainsonina na dose de 4g/kg (0,8mg de swainsonina/kg) até que os primeiros sinais clínicos neurológicos fossem observados. Após isso, o fornecimento da planta foi suspenso]. O Grupo II constituiu o grupo controle, constituído pelos Caprinos 7-8, que ficaram sob as mesmas condições de manejo que os caprinos do Grupo I, porém não receberam I. marcellia na dieta.
Biópsias hepáticas foram realizadas no dia zero e com intervalos semanais em todos os caprinos, totalizando sete coletas em cada animal. Utilizou-se a técnica de biópsia hepática percutânea cega com agulha de Menghini. Para isso, uma agulha de Menghini foi introduzida no sentido crânio-ventral, no 11º espaço intercostal direito, no ponto de interseção com uma linha imaginária paralela à coluna vertebral, partindo da extremidade lateral da tuberosidade ilíaca. Após ultrapassar a parede torácica a agulha foi introduzida no parênquima hepático, por dois a três centímetros para que se procedesse à coleta das amostras. Em cada procedimento, as biópsias foram repetidas até se obter um fragmento de tecido com tamanho adequado para avaliação histológica. Os fragmentos oriundos das biópsias hepáticas foram fixados em formol tamponado 10%, processados rotineiramente para inclusão em parafina e cortados a três micrômetros de espessura. Após isso, as lâminas foram coradas pela hematoxilina-eosina (HE) e submetidas à técnica de histoquímica de lectinas.
A análise histológica das lâminas coradas em HE foi realizada em microscopia de luz e as lesões observadas foram classificadas de acordo com o grau de comprometimento dos hepatócitos em grau 0 (ausência de lesões), grau 1 (discreto comprometimento do parênquima, pequena quantidade de hepatócitos com núcleo central e citoplasma contendo discreta vacuolização citoplasmática), grau 2 (comprometimento do parênquima pela presença de hepatócitos necróticos e moderada vacuolização citoplasmática) e grau 3 (maioria dos hepatócitos necróticos e intensa e difusa vacuolização citoplasmática) (Quadro 1).
Para a histoquímica de lectinas, as lâminas foram desparafinadas, hidratadas, e incubadas em peróxido de hidrogênio a 10% com metanol por 30 minutos para bloqueio de peroxidases endógenas. Após a lavagem das lâminas com água deionizada, estas ficaram submersas por 40 minutos a 96 °C em tampão citrato (pH 6,0) para a recuperação antigênica em panela de pressão digital. O bloqueio de reações inespecíficas foi realizado com leite desnatado Molico® a 5 % por 30 minutos. Os cortes foram incubados “overnight” com lectinas (Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia, 94010, USA) na diluição de 2,5μg/mL em PBS, com exceção da lectina WGA, que foi diluída na proporção de 1,25μl/ml. Foram utilizadas as lectinas Canavalia ensiformis agglutinin (Con-A), Dolichos biflorus agglutinin (DBA), Arachis
hypogaea agglutinin (PNA), Ricinus communis agglutinin-I (RCA - I), Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-1), Triticum vulgaris agglutinin (WGA), Succinyl-WGA (sWGA), Griffonia simplicifolia agglutinin 1 (GSA-1), Pisum sativum (PSA), Phaseolus vulgaris erythroagglutinin (PHA-E) e Lens culinaris (LCA) (Lectin Kit Biotinylated BK 1000 e 2000, Vector
Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), e posteriormente incubadas com o complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories Inc.) por 20 minutos. Os cortes foram revelados com diaminobenzidine (DAB) (DAKO) por 5 minutos ou até atingir coloração marrom e contracorados com hematoxilina de Harris. Para cada lâmina foi realizado um controle negativo onde se seguiram os mesmos procedimentos, porém, sem adição de lectinas.
RESULTADOS
No parênquima hepático, lesões características de doença de depósito lisossomal foram identificadas, no 7º dia de consumo da planta, em todos os caprinos que consumiram I. marcellia (Quadro 1). Nessa fase inicial de intoxicação, os animais não apresentaram sinais clínicos neurológicos. Porém, foram observadas lesões hepáticas que consistiram em discreto comprometimento do parênquima, pequena quantidade de hepatócitos com núcleo central e citoplasma contendo múltiplos discreta vacuolização citoplasmática (Caprinos 1 e 3) (Fig. 1B) ou lesões que consistiam em moderado comprometimento do parênquima hepático com presença de hepatócitos necróticos (Caprinos 2 e 6) (Fig. 1C).
Quadro 1. Grau de comprometimento dos hepatócitos de caprinos intoxicados experimentalmente por I.
marcellia
*Presença de sinais clínicos
Entre 14-21 dias de experimento foram observadas lesões mais intensas, com comprometimento significativo do parênquima hepático, maioria dos hepatócitos necróticos e intensa e difusa vacuolização citoplasmática (Fig. 1D). Um achado constantemente observado foi a presença vacúolos grandes e únicos no citoplasma dos hepatócitos, consistentes com os de lipidose hepática nos caprinos de ambos os grupos experimentais. Sinais clínicos neurológicos característicos de doença de depósito lisossomal só foram observados a partir do 27º dia de consumo da planta nos Caprinos 1-4 e 6. O Caprino 5 apresentou doença clínica a partir do 22º dia de consumo da planta. Os sinais clínicos consistiram principalmente em deficiências proprioceptivas, com alterações de equilíbrio, postura e coordenação. Emagrecimento progressivo, pelos arrepiados, opacos e quebradiços também foram observados.
Intensidade das lesões
Caprino n Dia Dia zero o 1ª coleta 2ª coleta 3ª coleta 4ª coleta 5ªcol 5ª coleta 6ª coleta 7ª coleta
01 0 1 2 3 3* 3* 3* 2* 02 0 2 2 3 3* 3* 3* 2* 03 0 1 3 3 3* 2* 2* 1* 04 0 2 2 3 3* 3* 3* 2* 05 0 3 3 3 3* 3* 2* 2* 06 0 2 2 2 3* 3* 2* 1* 07 0 0 0 0 0 0 0 0 08 0 0 0 0 0 0 0 0
Fig.1. Doença de depósito lisossomal (DDL) induzida pelo consumo de I. marcellia em caprinos. Aspecto histológico das lesões hepáticas. (A) Parênquima hepático de caprino do grupo controle sem evidência de
vacuolização hepática. (B) Comprometimento hepático grau 1. Pequena quantidade de hepatócitos com núcleo central e citoplasma contendo múltiplos vacúolos diminutos. (C) Comprometimento hepático grau 2. Hepatócitos necróticos e moderada vacuolização citoplasmática (D) Comprometimento hepático grau 3. Hepatócitos necróticos e intensa e difusa vacuolização citoplasmática. Coloração: HE.
Em relação à intensidade das lesões hepáticas, não houve diferença significativa quando se compararam as lâminas coradas por hematoxilina-eosina e histoquímica de lectinas. As lâminas coradas por histoquímica de lectinas apresentavam graus variáveis de marcação, desde leves a moderadas. As marcações mais intensas nos hepatócitos dos caprinos do Grupo I foram obtidas com as lectinas Con-A e WGA (Fig 2A e 2C) quando comparadas ao controle negativo (Fig. 2B). As lectinas RCA, PNA e DBA mostraram moderada reatividade. As lectinas PSA, UEA I, s-WGA e GSA I apresentaram reatividade leve. As lectinas PHA-E e LCA não apresentaram marcação. As áreas de vacuolização hepatocelular consistentes com lipidose hepática não apresentaram reatividade para as lectinas utilizadas.
Fig.2. Doença de depósito lisossomal (DDL) induzida pelo consumo de I. marcellia em caprinos. Aspecto histológico das lesões hepáticas marcadas com lectinas. (A) Acentuada reatividade para a lectina Con-A em biópsia
hepática com comprometimento grau 2. (B) Controle negativo com ausência de reatividade em hepatócitos. (C) Acentuada reatividade para a lectina WGA em biópsia hepática com comprometimento grau 1. (D) Acentuada reatividade para a lectina Con-A em biópsia hepática com comprometimento grau 2 com a presença de vacúolos de lipidose hepatocelular (não reativos).
DISCUSSÃO
No semiárido nordestino, caprinos que consomem I. carnea subsp. fistulosa podem ser identificados por apresentarem manchas (nódoas) na boca ocasionadas pela lactescência da planta (Pimentel et al. 2012). Porém, na maioria das vezes, essa avaliação é insuficiente e inespecífica por se aplicar a várias plantas lactescentes, em sua maioria, desprovidas de toxicidade. Por isso, na maioria dos casos a doença não é diagnosticada antes do aparecimento de disfunção cerebelar.
Nesse sentido, a técnica de biópsia hepática foi eficiente para identificar precocemente lesões hepáticas provocadas pela swainsonina. Ressalta-se que essas lesões puderam ser identificadas após sete dias de ingestão da planta, mesmo com concentrações baixas de swainsonina nas folhas de I. marcellia (0,02%). Essa eficácia é bastante importante para o diagnóstico da doença, tendo em vista que a concentração de swainsonina em outras plantas que provocam doença de depósito lisossomal podem variar muito, e.g. 0,14% e 0,11% em amostras de I. riedelli e I.
sericophylla (Barbosa et al. 2006), 0,14% em I. martii (Riet-Correa et al. 2009) e 0,05% em I. carnea subsp. fistulosa
(Adrien et al. 2013).
A intensidade variável das lesões observadas nas biópsias pode ser explicada por uma sensibilidade individual de cada animal, pois os caprinos ingeriram a mesma quantidade diária de swainsonina. Levando isso em consideração,
a técnica pode auxiliar os médicos veterinários de campo a identificar caprinos que possuem o hábito de ingerir plantas que contém swainsonina, mas que ainda não estejam apresentando sinais clínicos neurológicos. A identificação precoce desses animais é importante, principalmente porque entre ruminantes ocorre o mecanismo de facilitação social, onde animais que não ingerem determinadas plantas passam a ingeri-las na presença de outros que as ingerem (Riet-Correa & Méndez 2007). Dessa maneira, os caprinos que apresentam doença subclínica podem ser removidos para áreas livres de plantas que contém swainsonina para que se recuperem, evitando assim que a doença se difunda no rebanho.
Em fazendas do semiárido nordestino onde se tem o conhecimento prévio sobre a ocorrência de plantas que contém swainsonina, a presença de vacuolização hepática em caprinos pode ser presumivelmente considerada como decorrente da ingestão de plantas que provocam doença de depósito lisossomal, visto que as lesões não se confundem com as vacuolizações presentes na hepatopatia por lipidose (McGavin & Zachary 2009). A técnica de biópsia hepática associada à histoquímica de lectinas pode ainda ser aplicada ao diagnóstico da doença em ruminantes que pastejam em áreas onde não se tem conhecimento da existência de plantas que contém swainsonina. Porém, para confirmação sobre o tipo de armazenamento é necessária à utilização de lectinas (Mendonça et al. 2012). Em casos de suspeita de α- manosidoses as lectinas Con-A e WGA podem ser utilizadas com segurança, pois os resultados desse experimento comprovaram que essas lectinas apresentaram maior intensidade de marcação.
CONCLUSÕES
Conclui-se que a biópsia hepática é eficiente para diagnosticar a doença de depósito lisossomal entre 7-20 dias antes do aparecimento dos primeiros sinais clínicos em caprinos intoxicados por I. marcellia.
REFERÊNCIAS
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McGavin M.D. & Zachary J.F. Bases da patologia em veterinária. 2009. 4° Edição. Rio de Janeiro: Elsevier. 1476p. Mendonça F.S., Albuquerque R.F., Evêncio-neto J., Freitas S.H., Dória R.G.S., Boabaid F.M., Driemeier D., Gardner D.R.,
Riet-Correa F. & Colodel E.M. 2012. Alpha-mannosidosis in goats caused by the swainsonine-containing plant
Oliveira C.A., Barbosa J.D., Duarte M.D., Cerqueira V.D., Riet-Correa F. & Riet-Correa G. 2009. Intoxicação por Ipomoea
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Oliveira C.A., Duarte M.D., Cerqueira V.D., Riet-Correa F., Riet-Correa B., Vinhote W.M.S. & Riet-Correa G. 2010. Indução de aversão condicionada em caprinos recém adaptados a ingerir Ipomoea carnea subsp. fistulosa. In: VI Encontro Nacional de Diagnóstico Veterinário, Campo Grande, MS. Anais... Campo Grande: Colégio Brasileiro de Patologia Animal.
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Pimentel L. A., Maia L.A., Campos E.M., Dantas A.F.M., Medeiros R.M.T., Pister J.A., Cook D. & Riet-Correa F. 2012. Aversão alimentar condicionada no controle de surtos de intoxicações por Ipomoea carnea subsp. fistulosa e Turbina
cordata. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 32, n.8, p.707-714.
Riet-Correa F. & Méndez M. D. C. 2007. Intoxicação por plantas e micotoxinas, p.99-219. In. Riet-Correa F., Schild A. L., Lemos A. A. & Borges J. R. (Eds), Doenças de Ruminantes e Eqüídeos. Vol. 2. 3ª ed. Pallotti, Santa Maria. 694p. Riet-Correa F., Pfister J., Shild A.L., Medeiros R.M., Dantas A.F.M. 2009. Poisonings by plants, mycotoxins and related
5. ANEXO
Instruções para Autores – Revista Pesquisa Veterinária Brasileira
Os trabalhos para submissão devem ser enviados por via eletrônica, através do e-mail
<jurgen.dobereiner@pvb.com.br>, com os arquivos de texto na versão mais recente do Word e formatados de acordo com o modelo de apresentação disponível no site da revista (www.pvb.com.br. Devem constituir-se de resultados de pesquisa ainda não
publicados e não considerados para publicação em outra revista.
Para abreviar sua tramitação e aceitação, os trabalhos sempre devem ser submetidos conforme as normas de apresentação da revista (www.pvb.com.br) e o modelo em Word (PDF no site). Os originais submetidos fora das normas de apresentação, serão devolvidos aos autores para a devida adequação.
Apesar de não serem aceitas comunicações (Short communications) sob forma de “Notas Científicas”, não há limite mínimo do número de páginas do trabalho enviado, que deve, porém, conter pormenores suficientes sobre os experimentos ou a metodologia empregada no estudo. Trabalhos sobre Anestesiologia e Cirurgia serão recebidos para submissão somente os da área de Animais Selvagens.
Embora sejam de responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos trabalhos, o Conselho Editorial, com a assistência da Assessoria Científica, reserva-se o direito de sugerir ou solicitar modificações aconselháveis ou necessárias. Os trabalhos submetidos são aceitos através da aprovação pelos pares (peer review).
NOTE: Em complementação aos recursos para edição da revista (impressa e online) e distribuição via correio é cobrada taxa de publicação (page charge) no valor de R$ 250,00 por página editorada e impressa, na ocasião do envio da prova final, ao autor para correspondência.
1. Os trabalhos devem ser organizados, sempre que possível, em Título, ABSTRACT,
RESUMO, INTRODUÇÃO, MATERIAL E MÉTODOS, RESULTADOS,
DISCUSSÃO, CONCLUSÕES (ou combinação destes dois últimos), Agradecimentos e REFERÊNCIAS:
a) o Título do artigo deve ser conciso e indicar o conteúdo do trabalho; pormenores de identificação científica devem ser colocados em MATERIAL E MÉTODOS.
b) O(s) Autor(es) deve(m) sistematicamente encurtar os nomes, tanto para facilitar sua identificação científica, como para as citações bibliográficas. Em muitos casos isto significa manter o primeiro nome e o último sobrenome e abreviar os demais sobrenomes:
Paulo Fernando de Vargas Peixoto escreve Paulo V. Peixoto ou Peixoto P.V.; Franklin Riet-Correa Amaral escreve Franklin Riet-Correa ou Riet-Correa F.; Silvana Maria Medeiros de Sousa Silva poderia usar Silvana M.M.S. Silva, inverso Silva S.M.M.S., ou Silvana M.M. Sousa-Silva, inverso, Sousa-Silva S.M.M., ou mais curto, Silvana M. Medeiros-Silva, e inverso, Medeiros-Silva S.M.; para facilitar, inclusive, a moderna indexação, recomenda-se que os trabalhos tenham o máximo de 8 autores;
c) o ABSTRACT deverá ser apresentado com os elementos constituintes do RESUMO em português, podendo ser mais explicativos para estrangeiros. Ambos devem ser seguidos de “INDEX TERMS” ou “TERMOS DE INDEXAÇÃO”, respectivamente;
d) o RESUMO deve apresentar, de forma direta e no passado, o que foi feito e estudado, indicando a metodologia e dando os mais importantes resultados e conclusões. Nos trabalhos em inglês, o título em português deve constar em negrito e entre colchetes, logo após a palavra RESUMO;
e) a INTRODUÇÃO deve ser breve, com citação bibliográfica específica sem que a mesma assuma importância principal, e finalizar com a indicação do objetivo do trabalho;
f) em MATERIAL E MÉTODOS devem ser reunidos os dados que permitam a repetição do trabalho por outros pesquisadores. Na experimentação com animais, deve constar a aprovação do projeto pela Comissão de Ética local;
g) em RESULTADOS deve ser feita a apresentação concisa dos dados obtidos. Quadros devem ser preparados sem dados supérfluos, apresentando, sempre que indicado, médias de várias repetições. É conveniente, às vezes, expressar dados complexos por gráficos (Figuras), ao invés de apresentá-los em Quadros extensos;
h) na DISCUSSÃO devem ser discutidos os resultados diante da literatura. Não convém mencionar trabalhos em desenvolvimento ou planos futuros, de modo a evitar uma obrigação do autor e da revista de publicá-los;
i) as CONCLUSÕES devem basear-se somente nos resultados apresentados no trabalho; j) Agradecimentos devem ser sucintos e não devem aparecer no texto ou em notas de rodapé;
k) a Lista de REFERÊNCIAS, que só incluirá a bibliografia citada no trabalho e a que tenha servido como fonte para consulta indireta, deverá ser ordenada alfabeticamente pelo sobrenome do primeiro autor, registrando-se os nomes de todos os autores, em caixa alta e baixa (colocando as referências em ordem cronológica quando houver mais de dois autores), o título de cada publicação e, abreviado ou por extenso (se tiver dúvida), o nome da revista ou obra, usando as instruções do “Style Manual for Biological Journals” (American Institute for Biological Sciences), o “Bibliographic Guide for Editors and Authors” (American Chemical Society, Washington, DC) e exemplos de fascículos já publicados (www. pvb.com.br).
2. Na elaboração do texto deverão ser atendidas as seguintes normas:
a) os trabalhos devem ser submetidos seguindo o exemplo de apresentação de fascículos
recentes da revista e do modelo constante do site sob “Instruções aos Autores” (www.pvb.com.br). A digitalização deve ser na fonte Cambria, corpo 10, entrelinha simples; a página deve ser no formato A4, com 2cm de margens (superior, inferior,
esquerda e direita), o texto deve ser corrido e não deve ser formatado em duas colunas, com as legendas das figuras e os Quadros no final (logo após as REFERÊNCIAS). As Figuras (inclusive gráficos) devem ter seus arquivos fornecidos separados do texto. Quando incluídos no texto do trabalho, devem ser introduzidos através da ferramenta “Inserir” do Word; pois imagens copiadas e coladas perdem as informações do programa onde foram geradas, resultando, sempre, em má qualidade;
b) a redação dos trabalhos deve ser concisa, com a linguagem, tanto quanto possível, no passado e impessoal; no texto, os sinais de chamada para notas de rodapé serão números arábicos colocados em sobrescrito após a palavra ou frase que motivou a nota. Essa numeração será contínua por todo o trabalho; as notas serão lançadas ao pé da página em que estiver o respectivo sinal de chamada. Todos os Quadros e todas as Figuras serão mencionados no texto. Estas remissões serão feitas pelos respectivos números e, sempre que possível, na ordem crescente destes. ABSTRACT e RESUMO serão escritos corridamente em um só parágrafo e não deverão conter citações bibliográficas.
c) no rodapé da primeira página deverá constar endereço profissional completo de todos
os autores e o e-mail do autor para correspondência, bem como e-mails dos demais autores (para eventualidades e confirmação de endereço para envio do fascículo impresso);
d) siglas e abreviações dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira vez no trabalho, serão colocadas entre parênteses e precedidas do nome por extenso;
e) citações bibliográficas serão feitas pelo sistema “autor e ano”; trabalhos de até três autores serão citados pelos nomes dos três, e com mais de três, pelo nome do primeiro, seguido de “et