Procedimentos em facoemulsificação foram realizados nos próprios do Serviço de Oftalmologia do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”. Procedimentos em microbiologia e em biologia molecular o foram no Laboratório de Epidemiologia Molecular, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
3.2. Considerações quanto à ética
A pesquisa foi realizada atendendo-se às normas da Association for Research
in Vision and Ophthalmology - ARVO (National Institutes of Helth Publications No 85-
23: Revised 1985), de consoante com o código de NÜREMBERG (GOLDIM, 1995) e às da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), sob o número de protocolo 014628/12, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
3.3. Pacientes
Foram utilizados 20 cães de raças variadas, machos ou fêmeas, acometidos por catarata bilateral, não diabética imatura ou madura. Selecionaram-se os indicados para facectomia eletiva, por facoemulsificação, com implante de lente intraocular. Como medidas preliminares, eles passaram por exame oftálmico baseado nos testes dos reflexos, no da lágrima de Schirmer1, na biomicroscopia com lâmpada em fenda2, na gonioscopia3 em córneas previamente dessensibilizadas com proximetacaína à 0,5%4, nas oftalmoscopias binocular indireta5 e monocular
1
Teste de Schirmer - Ophthalmos, São Paulo, Brasil.
2 SL-450 - Nidek Co, Japan.
3 Koeppe Medium Diagnostic Lens 18mm - Ocular Instruments Inc., USA. 4 Anestalcon - Alcon Laboratórios do Brasil Ltda.
direta6, na tonometria de aplanação7 e no teste de tingimento pela fluoresceína
sódica8. Ultrassonografia ocular9 e eletrorretinografia10 foram conduzidas a fim de
excluírem doenças do vítreo e da retina.
Foram incluídos somente pacientes sem afecções sistêmicas e locais concorrentes e sem sequelas de inflamação ocular. Para a avaliação das condições clínicas gerais, foram realizados exame físico, contagem global de células do sangue, avaliação das funções hepática e renal e da glicemia.
3.4. Procedimentos
3.4.1. Terapia pré-operatória
O pré-operatório teve início com sete dias, instilando-se colírio a base de dexametasona associada à tobramicina11, a intervalos regulares de seis horas. Empregou-se colírio de sulfato de atropina à 1%12, aos trinta minutos prévios ao
procedimento cirúrgico. Utilizou-se a flunixina meglumina13, em dose única de 1 mg/kg, pela via intramuscular, aos trinta minutos prévios ao ato operatório.
3.4.2. Anestesia
Após jejum alimentar e hídrico de doze e seis horas, respectivamente, os
pacientes foram pré-medicados com meperidina14, na dose de 0,005 mg/kg, pela via
intramuscular, associada ao diazepam15, na dose de 0,3 mg/kg. Decorridos quinze
minutos, realizou-se a indução à anestesia com propofol16, na dose média de 5 mg/kg, pela via intravenosa. Para a manutenção da anestesia, empregou-se
6 7100 - C - Welch Allyn, Ontário, Canadá. 7 Tonopen XL - Mentor Inc, Norwell.
8 Fluoresceína strips - Ophthalmos, São Paulo, Brasil. 9 UltraScan Imaging System - Alcon do Brasil SA. 10 Handheld Multi-species ERG - Retvetcorp. 11 Tobradex ® - Alcon do Brasil.
12 Atropina 1% - Allergan Produtos Farmacêuticos. 13 Banamine - Schering Plough.
14 Fentanest - Cristália. 15 Diazepamil - Hipolabor. 16 Profolen - Blausiegel.
anestésico halogenado17, vaporizado em oxigênio, em circuito de reinalação semi-
fechado.
Visando ao melhor posicionamento do olho e à diminuir a tensão da musculatura extraocular, realizou-se bloqueio neuro-muscular com brometo de rocurônio18, na dose de 0,3 mg/kg, pela via intravenosa, e ventilação assistida, após posicionamento do paciente e antes do procedimento cirúrgico.
3.4.3. Antissepsia e Procedimentos em Facoemulsificação
Os pacientes foram posicionados em decúbito dorsal e a área operatória tricotomizada. Ambos os olhos foram submetidos à antissepsia, cada um separadamente, imediatamente antes do procedimento cirúrgico. Para a antissepsia da superfície peripalpebral empregou-se solução aquosa de iodopirrolidona 10%19, com o auxílio de gaze estéril, após colocação de luva também estéril. Para a superfície ocular utilizou-se a mesma solução, diluída na proporção 1:50, em solução salina20, sendo preparada imediatamente antes de sua aplicação.
Após a colocação dos campos cirúrgicos, foram efetuadas cantotomia, quando necessária, e blefarostase mecânica. A técnica cirúrgica adotada foi a facoemulsificação bimanual, com duas incisões, uma principal e outra auxiliar, ambas localizadas em córnea clara a, aproximadamente, 1,0 mm do limbo. A principal foi tunelizada, em posição 11 horas, utilizando-se bisturi angulado 3,2
mm21. A auxiliar, situada em posição duas horas, foi confeccionada empregando-se
bisturi reto22. A câmara anterior foi preenchida com corante de cápsula23. Em ato
contínuo, ela foi lavada com solução salina balanceada (BSS), para remoção de remanescentes do corante. Como soluções viscoelásticas, foram utilizados o sulfato
de condroitina à 4%, o hialuronato de sódio à 3% e o hialuronato de sódio à 1%24.
Com o auxílio de um cistítimo, fez-se a incisão na cápsula anterior, seguida de
17 Isoforine - Cristália.
18 Esmeron - Akzo Organon Teknika.
19 Laboriodine PVPI tópico - Laboratórios Biosintética. 20
Solução fisiológica - Cloreto de sódio 0,9% - Baxter Hospitalar.
21 Surgical knife 3.2mm - Alcon labs.
22 Bisturi reto est. 15,0 graus desc. Estéril - Alcon labs. 23 Azul de tripan® - Ophthalmos.
capsulorrexe curvilínea contínua, com pinça de Utrata. Com seringa acoplada a uma cânula de irrigação, realizou-se a hidrodissecção do núcleo, empregando-se solução salina balanceada.
Para as facectomias, empregou-se facoemulsificador25 e bolsa de 500 mL de
BSS acrescida de 1 mL de epinefrina26 1:1000 e de 1 mL de heparina sódica27 25.000 UI. Com o pedal na posição 1 (estágio de irrigação), a ponteira da caneta de facoemulsificação foi introduzida na câmara anterior e, posteriormente, no saco capsular. Empregou-se a técnica “dividir e conquistar”, para a emulsificação e a aspiração do núcleo, utilizando, quando oportuno, a função em bomba peristáltica. Para a aspiração das massas corticais e da substância viscoelástica remanescentes, empregou-se a função irrigação e aspiração.
Os pacientes receberam lente acrílica dobrável28, posicionada no saco capsular, com a porção óptica centralizada e as hápticas inseridas no equador. A incisão corneal foi suturada com pontos simples separados, não-perfurantes totais, empregando-se fio absorvível poliglactina 910 9-029. A câmara anterior foi
preenchida com BSS (Fig. 1). Nos casos em que a cantotomia fora realizada, empregaram-se pontos simples separados com fio inabsorvível monofilamentado 4- 030, na síntese do canto temporal.
Ao término da cirurgia, foram contabilizados os referenciais de cada ato cirúrgico, relativamente ao tempo de ultrassom, ao quantitativo de solução salina balanceada e quanto às intercorrências cirúrgicas.
25Facoemulsificador Universal II - Alcon do Brasil. 26 Epinefrina - Cristália.
27 Heparina sódica - Ariston Ltda.
28 30-V 12,0/ 30-V 14,0 - Acrivet, Hennigsdorf, Germany. 29 Vicryl 9-0 - Ethicon.
3.4.4. Terapia pós-operatória
Foram adotados prednisona31, por via oral, na dose de 1 mg/kg, a intervalos
de 24 horas, por 15 dias consecutivos, com redução gradual da dose nos 15 dias
subsequentes. Colírios à base de dexametasona associada à tobramicina11, 1 gota
em cada olho, a cada quatro horas, por 7 dias e, a seguir, a cada seis horas, por 21 dias mínimos. E colírios à base de diclofenaco sódico32, 1 gota em cada olho, a cada seis horas, por 30 dias; à base de brinzolamida à 1%33, a intervalos de 12 horas,
sendo 1 gota em cada olho, por sete dias, e à base de atropina à 1%12, 1 gota em
cada olho, a cada 12 horas, por três dias consecutivos. Todos os pacientes foram mantidos com colar do tipo Elizabethano, por 21 dias mínimos e recebiam indicação de limpeza da região peripalpebral com solução salina34.
31 Meticorten - Schering Plough.
32 Still - Allergan Produtos Farmacêuticos. 33 Azopt - Alcon Laboratórios do Brasil Ltda. 34
Solução fisiológica - Cloreto de sódio 0,9% - Baxter Hospitalar.
FFigura 1. Imagem fotográfica ilustrando lente intraocular em paciente da espécie canina submetido à facoemulsificação no pós- operatório imediato. As setas indicam pontos de sutura corneais. Jaboticabal, SP, 2013.
3.5. Amostras
Foram colhidas amostras de secreções nasal e conjuntival dos olhos direito e esquerdo, separadamente, imediatamente à indução da anestesia geral, com swabs estéreis umedecidos em solução salina35, antes da realização da antissepsia. Após a antissepsia de um dos olhos, colheu-se 0,5 mL de humor aquoso, posteriormente à abertura da câmara anterior e imediatamente antes da aplicação do último ponto da sutura corneal, quando findada a facoemulsificação. Empregou-se seringa de 3,0 mL acoplada à agulha de insulina. Após o término do ato cirúrgico do primeiro olho, o olho contralateral foi submetido ao mesmo procedimento de antissepsia e colheita de humor aquoso. As amostras foram colhidas em duplicata para o cultivo bacteriano em aerobiose e em anaerobiose, seguindo-se os critérios: (i) duas amostras de secreção nasal; (ii) duas de secreção conjuntival do olho direito e duas do olho esquerdo; (iii) oito amostras de humor aquoso, sendo quatro do olho direito e quatro do olho esquerdo, duas colhidas logo após a incisão corneal e duas imediatamente antes de sua sutura. Colheram-se, portanto, 14 amostras por paciente, totalizando 280 amostras.
As amostras foram numeradas de 1 a 20, de consoante com o paciente operado, e identificadas seguindo-se os critérios: (i) amostras de secreção nasal (N) (Fig.2); (ii) amostras de secreção conjuntival do olho direito (CD); (iii) amostras de secreção conjuntival do olho esquerdo (CE) (Fig. 3); (iv) amostras de humor aquoso do olho direito, coletadas posteriormente à incisão corneal (HDA); (v) amostras de humor aquoso do olho direito, coletadas imediatamente antes da sutura corneal (HDD); (vi) amostras de humor aquoso do olho esquerdo, coletadas posteriormente à incisão corneal (HEA); e (vii) amostras de humor aquoso do olho esquerdo, coletadas imediatamente antes da sutura corneal (HED).
Após as colheitas, todas as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Epidemiologia Molecular (LEM), do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal, decorridas, no máximo, duas horas de sua colheita. Onde foram processadas e armazenadas.
Figura 3. Imagem fotográfica ilustrando coleta de secreção conjuntival, com swab estéril, em paciente da espécie canina. Jaboticabal, SP, 2013.
Figura 2. Imagem fotográfica ilustrando coleta de secreção nasal com swab estéril, em paciente da espécie canina. Jaboticabal, SP, 2013.
3.5.1. Contagem de unidades formadoras de colônia, por mL (UFC/mL), do humor aquoso e cultivo bacteriano das amostras em caldo Brain Hearth Infusion (BHI)
Para a contagem de UFC/mL, realizaram-se diluições seriadas de amostras de humor aquoso, sendo 0,2 mL de cada uma foi transferido para tubos de ensaio contendo 1,8 mL de solução salina à 0,9% (diluição 10-1), utilizada para as demais diluições, até a diluição 10-6. De cada uma das diluições 10-2, 10-4 e 10-6, foram transferidas alíquotas de 100 µL para placas de Petri contendo Ágar de Contagem36. Empregaram-se alças de Drigalski estéreis para se espalharem as células homogeneamente nas placas. Posteriormente, elas foram incubadas à 37°C, por 18 horas. Após incubação, placas com colônias variando entre 10 a 100 unidades foram contadas e o resultado foi multiplicado pelo fator de diluição correspondente, obtendo-se quantitativo em UFC/mL.
O cultivo foi realizado a partir dos swabs contendo, individualmente, secreção nasal e secreção conjuntival e de amostras de 0,250 mL de humor aquoso. O material foi introduzido em tubos contendo 5,0 mL de caldo BHI (Brain Heart
Infusion)37. Um tubo de cada amostra foi incubado à 37°C por 18 horas, em
aerobiose, e o outro em anaerobiose, utilizando-se jarra e kit Anaerobac38.
3.5.2. Extração do DNA, por fervura
Amostras com crescimento bacteriano em caldo BHI foram submetidas à extração do DNA pelo método de fervura. Para tal, 1,0 mL do cultivo foi transferido para eppendorfs de 2,0 mL. Os tubos foram centrifugados por 2 minutos à 13.400xg. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e ao pellet de colônias foi acrescentado 1,0 mL de solução PBS (8 mM Na2HPO4.12H2O; 1,76 mM KH2PO4;
137 mM NaCl; 2,7 mM KCl). O pellet foi dissolvido com o auxílio de vortex e, a seguir, as amostras foram centrifugadas novamente sob as mesmas condições anteriores. O sobrenadante foi descartado e ao pellet foi acrescido 0,5 mL de água
36 Plate Count Ágar - Sigma.
37 Brain Heart Infusion Broth - Oxoid. 38 Anaerobac - Probac do Brasil.
milli-Q estéril, na qual o pellet foi dissolvido. A extração de DNA foi realizada por fervura, em equipamento térmico39, à temperatura de 99°C, por 10 minutos.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas e 0,4 mL do sobrenadante foi transferido para tubos novos.
3.5.3. Polimerase Chain Reaction (PCR) espécie-específica
O DNA obtido foi submetido à PCR para identificação quanto à presença de Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. e Pseudomonas spp. nas amostras, a fim de que as que apresentassem os patógenos fossem submetidas a isolamento de colônias puras. Os gêneros e a espécie bacterianos escolhidos foram selecionados levando-se em conta a literatura compulsada, que reporta serem os mais encontrados (ANDRADE et al., 2002; PRADO et al., 2005; WANG et al., 2008). Na PCR com os primers coa_f/coa_r e pta_f1/pta_r1 utilizou-se a cepa padrão de Staphylococcus aureus ATCC (American Type Culture Collection) 6538 (Departamento de Patologia Veterinária/Laboratório de Microbiologia Veterinária/UNESP/Câmpus de Jaboticabal). Na amplificação com os primers Ps_for/Ps_rev, utilizou-se cepa padrão de Pseudomonas aeruginosa (doada pelo Centro de Pesquisa em Virologia/Laboratório de Virologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP/Câmpus de Ribeirão Preto).
As amostras que apresentaram crescimento bacteriano em anaerobiose
foram submetidas à PCR de amplificação com os primers C1 (5’ -
GCGTGCCTAATACATGCAA - 3’) e C2 (5’ - TACAACGCAGGTCCATCT - 3’) C2
(MEIRI-BENDEK et al., 2002), utilizando cepa padrão de Streptococcus pneumoniae (doada pelo Centro de Pesquisa em Virologia/Laboratório de Virologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP/Câmpus de Ribeirão Preto).
Para a PCR de amplificação dos fragmentos (Tab. 1), utilizaram-se tampão 1X [100 mM Tris-HCl pH 8,8; 500 mM KCl; 0,8% (v/v) Nonidet P40]; MgCl2 2 mM;
dNTP’s 0,2 mM, 1,5 U de Taq DNA polimerase, 5 pmol de cada primer, 100 ng de DNA genômico e água pura estéril q.s.p. 20 L. A amplificação foi realizada em
termociclador40, programado para um ciclo à 95ºC, por 4 minutos; 35 ciclos à 94ºC,
por 30 segundos; temperatura de anelamento do primer, por 30 segundos e 72ºC, por um minuto. Finalizando, realizou-se um ciclo à 72ºC por 10 minutos. As amostras
foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), contendo corante41 e
padrão de tamanho molecular42. Os fragmentos foram visibilizados sob luz
ultravioleta, em equipamento de fotodocumentação43.
Tabela 1. Agentes pesquisados (Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. e Pseudomonas spp.), e respectivos alvos, primers, sequências de oligonucleotídeos e tamanhos, em pares de bases (pb), utilizados nas PCRs espécie-específicas das amostras de secreções nasal, conjuntival e de humor aquoso de pacientes da espécie canina submetidos à facoemulsificação com implante de lente intraocular. Jaboticabal, SP, 2013.
Agente Alvo Primer Sequência de oligonucleotídeos Tamanho (pb)
Staphylococcus.
aureusa coa coa_f coa_r TAAGAAATATGCTCCGATTGTCG GAACAAAGCGGCCCATCATTA 930
Staphylococcus
spp.b pta pta_f1 pta_r1 GCATAAACAAGCATTGTACCG AAAGACAAACTTTCAGGTAA 320
Pseudomonas spp.c
16S
rRNA Ps_revPs_for GGTCTGAGAGGATGATCAGT TTAGCTCCACCTCGCGGC 990
Fonte: aWALKER et al., 1998; bBANNOEHR et al., 2009; cWIDMER et al., 1998.
3.5.4. Obtenção de isolados
Amostras com amplificação para as bactérias em secreções nasal, conjuntival e do humor aquoso foram submetidas ao isolamento de colônias. As positivas para genes relacionados ao gênero Staphylococcus spp. e à Pseudomonas spp. foram repicadas em Agar Sal Manitol44 e em Ágar Cetrimida45, respectivamente, em
aerobiose. As placas foram mantidas em estufa incubadora à 37ºC, por 18 horas. As
40 Veriti Thermal Cycler - Applied Biosystems®. 41 SYBR® Safe DNA Gel Stain - InvitrogenTM. 42 100pb DNA Ladder - InvitrogenTM.
43 GEL DOC XR - BioRad. 44 Oxoid - England. 45 Himedia - India.
positivas para Streptococcus spp. foram repicadas em Agar Sangue Azida Base46,
suplementado com sangue desfibrinado de ovino (8%) e incubadas em anaerobiose. As placas foram mantidas em estufa incubadora à 37ºC, por 18 horas.
As amostras negativas na PCR, porém, com crescimento bacteriano na secreção nasal ou conjuntival47 e, ao mesmo tempo, no humor aquoso, foram repicadas em Ágar BHI, em duplicada, e mantidas em estufa à 37C, por 18 horas, em aerobiose e em anaerobiose.
3.5.5. Extração do DNA dos isolados
A fim de se obter quantitativo de bactéria necessário para a extração de DNA, cada colônia isolada foi repicada em tubos contendo caldo BHI, que foram mantidos em estufa incubadora à 37ºC, por 18 horas.
Utilizou-se o protocolo de Kuramae-Izioka (1997), para as extrações de DNA, permitindo a obtenção de DNA em quantidade, qualidade e integridade necessários. Aliquotou-se 1,0 mL do cultivo bacteriano, transferido para tubos eppendorf de 2,0 mL. Os tubos foram centrifugados a 13.400 x g, por 2 minutos, para a obtenção do pellet de células, ressuspendido em 700 µL de tampão de extração [Tris-HCl 160 mM pH 8,0, EDTA 50 mM pH 8,0, NaCl 20 mM e SDS 0,5% (p/v)]. Agitados, os tubos foram mantidos em banho-maria à 65ºC, por 40 minutos, período em que eram novamente agitados a cada 10 minutos. Em ato contínuo, acrescentaram-se 300 µL de acetato de potássio 5 M. Misturou-se a solução e incubou-se no gelo, por 30 minutos, invertendo-se, por aposição, os tubos a cada 15 minutos. Decorridos 30 minutos, as amostras foram retiradas do gelo e a elas foram acrescentados 650 µL de solução de clorofórmio e álcool isoamílico, na concentração de 24:1. A solução foi misturada por inversão, durante dois minutos, e novamente centrifugada à 13.400 x g, por 10 minutos à 10ºC. O sobrenadante, contendo o DNA foi transferido para tubos novos, cuidando-se para não tocar a interface inferior. Visando-se à precipitação do DNA, foram acrescentados 1000µL de etanol absoluto gelado. A solução foi misturada e mantida em freezer à -20ºC, overnight.
46 Oxoid - England.
Decorrida a precipitação do DNA em etanol, os tubos foram centrifugados à 13.400 x g, por 17 minutos, à 10ºC. A fase líquida foi descartada e o pellet foi lavado com 1000 µL de etanol 70% (v/v). Realizada uma segunda centrifugação, à 13.400 x g, por 10 minutos à 10ºC, a fase líquida foi novamente descartada e o pellet mantido para secar em estufa à 50ºC. Posteriormente, ele foi ressuspendido em 30 µL de tampão TE 10:1 (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0).
O quantitativo do DNA e o seu qualitativo foram avaliados, empregando-se a
espectofotometria48, medindo-se a absorbância de cada amostra nos comprimentos
de onda de 260 e 280 nm. A relação da absorbância entre os dois comprimentos de onda resultou em valor referente à qualidade do DNA, que estando no intervalo de 1,8 a 2,0, caracteriza-se como de boa qualidade (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). 3.5.6. Rep-PCR, para discriminação dos diferentes grupos bacterianos
Foram empregados dois primers para a amplificação dos fragmentos, o
BoxA1 (5’ - CGTCAGCGTCGCCTTGCCGTAG - 3’) associado ao BoxC1R (5’ -
AGCAAACTAGGAAGCTAGCCGC - 3’). Utilizaram-se tampão 1X [100 mM Tris-HCl
pH 8,8; 500 mM KCl; 0,8% (v/v) Nonidet P40]; MgCl2 2,5 mM; dNTP’s 0,2 mM, 1 U
de Taq DNA polimerase49, 10 pmol de cada primer, 60ng de DNA genômico e água
pura estéril q.s.p. 20 L. A amplificação se deu em termociclador50, programado para realizar 1 ciclo à 95ºC, por 4 minutos; 36 ciclos à 94ºC, por 40 segundos, 50ºC, por 40 segundos, e à 72ºC, por 1 minuto. Finalizando, um ciclo à 72ºC, por 10 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose à 1% (p/v), contendo brometo de etídio (0,5 g/mL) e padrão de tamanho molecular (PM) 100
pb51. Os fragmentos foram visibilizados sob luz UV, em equipamento de
fotodocumentação52.
48 NanoDrop 100 - Uniscience. 49 Taq DNA Polimerase - InvitrogenTM. 50 Veriti - Applied Biosystems.
51 DNA Ladder Plus - Fermentas. 52 GEL DOC XR - BioRad.
3.5.7. Sequenciamento da região 16S rDNA
A amplificação da região 16S rDNA foi realizada empregando-se par de
primers 8F (5’ - AGAGTTTGATYMTGGCTCAG - 3’) e 907R (5’ -
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT - 3’) (NERCESSIAN et al., 2005), para fragmento esperado de cerca de 900 pb. Relativamente à PCR de amplificação do fragmento, utilizou-se tampão 1X [100 mM Tris-HCl pH 8,8; 500 mM KCl; 0,8% (v/v) Nonidet
P40]; MgCl2 2 mM; dNTP’s 0,2 mM, 0,5 U de Taq53, 2,5pmol de cada primer, 8F e
907R, 60 ng de DNA genômico e água pura estéril q.s.p. 20 L. A amplificação foi realizada em termociclador54, programado para realizar 1 ciclo à 95ºC, por 4 minutos; 36 ciclos à 94ºC, por 40 segundos; à 60ºC por 40 segundos, à 72ºC por 1 minuto, e um ciclo à 72ºC, por 10 minutos. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% (p/v), contendo brometo de etídio (0,5 g/mL) e
padrão de tamanho molecular (PM) 100 pb55. Os fragmentos foram visibilizados sob
luz UV, em equipamento de fotodocumentação56.
O DNA do fragmento amplificado foi submetido à PCR de sequenciamento, utilizando-se o Big Dye Terminator v3.157, seguindo-se instruções do fabricante. A amplificação de sequenciamento foi realizada sob as mesmas condições descritas para amplificação do fragmento. O produto da PCR de sequenciamento foi precipitado em 80 L de isopropanol à 75% (v/v) e submetido à centrifugação à 3.220 x g à 15ºC, por 45 minutos. Posteriormente, a fase líquida foi descartada e o pellet foi lavado com 180 L de etanol à 70% (v/v). Após a lavagem, ele foi seco em concentrador à vácuo à 45ºC, por 5 minutos. O produto da PCR de sequenciamento foi submetido à desnaturação em formamida58, à temperatura de 95ºC, por 5 minutos. Após a desnaturação, as amostras foram colocadas no gelo a fim de se manterem as fitas de DNA desnaturadas. A leitura das bases foi realizada por um sequenciador59.
53 Taq DNA Polimerase - InvitrogenTM. 54 Veriti - Applied Biosystems.
55 DNA Ladder Plus - Fermentas. 56 GEL DOC XR - BioRad.
57 Big Dye Terminator v3.1 - Applied Biosystems. 58 Hi-DiTM Formamide - Applied Biosystems. 59 ABI 3100 - Applied Biosystems.
Eletroferogramas obtidos foram visibilizados, analisados em software60 e convertidos em sequências de nucleotídeos em software DNA Sequencing Analysis Software Versão 3.3. Eletroferogramas gerados foram submetidos ao pacote de programas Phred/Phrap/Consed (EWING; GREEN, 1998; GORDON; ABAJIAN; GREEN, 1998), para a avaliação do qualitativo, para o alinhamento e para o corte das extremidades. As sequências de DNA qualificadas foram comparadas em banco de dados (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), empregando-se a ferramenta