Frutos de laranjas, cultivar Pêra, sem tratamento com fungicidas, foram adquiridos no “packinghouse” da empresa Alfa Citrus, Engenheiro Coelho – SP. Esses frutos foram lavados e desinfestados superficialmente com hipoclorito de sódio.
Penicillium digitatum foi isolado de laranjas Pêra obtidas de um
supermercado de Jaguariúna – SP. O patógeno foi multiplicado em meio batata-dextrose-ágar (BDA) e incubado por 10 dias a 24±1 ºC. Antes da instalação do experimento, foi realizado teste de patogenicidade do isolado em frutos de laranja Pêra.
Nos ensaios foram utilizados os agentes de biocontrole Bacillus
subtilis (CHR HANSEN), Bacillus licheniformis (CHR HANSEN) e Bacillus subtilis (QST
713 - Serenade®) e o fungicida imazalil.
O trabalho foi composto por 10 tratamentos, em blocos casualizados, sendo combinado em esquema fatorial 2 x 5 (aplicação ou não do tratamento térmico associado aos cinco tratamentos): 1) Testemunha tratada com água, 2) Fungicida imazalil (100 g do i.a. 100 L de água), 3) Bacillus subtilis (3 x 108 UFC mL-1), 4) Bacillus licheniformis (3 x
108 UFC mL-1), 5) Bacillus subtilis (Serenade® - 1 x 106 UFC mL-1), 6) Testemunha com
tratamento térmico, 7) Fungicida imazalil + tratamento térmico, 8) Bacillus subtilis (3 x 108 UFC mL-1) + tratamento térmico, 9) Bacillus licheniformis (3 x 108 UFC mL-1) + tratamento térmico; e 10) Bacillus subtilis (Serenade® - 1 x 106 UFC mL-1) + tratamento térmico. Em cada tratamento, os frutos foram imersos por 2 minutos na suspensão de agentes de biocontrole,
suspensão do fungicida ou água destilada. Nos tratamentos com os agentes de biocontrole + tratamento térmico, os frutos foram imersos por 2 minutos em água a 52 ºC em um banho com circulação, contendo os biocontroladores. Imediatamente após, os frutos foram imersos em água em temperatura ambiente, também por 2 minutos, objetivando prevenir injúrias nos frutos pela elevada temperatura. No tratamento com fungicida + tratamento térmico, inicialmente foi realizado o tratamento térmico, resfriamento e, posteriormente, a imersão dos frutos por 2 minutos em solução com fungicida. Quando realizado apenas o tratamento térmico, os frutos foram tratados termicamente e então resfriados em água em temperatura ambiente.
Após o tratamento frutos foram secos em temperatura ambiente e armazenados por 28 dias em temperatura de 10 ºC e umidade relativa de 90%±5.
3.1. Controle de Penicillium digitatum com agentes de biocontrole e tratamento térmico seguido de armazenamento a temperatura de 10ºC
Foram usados 54 frutos por tratamento, constituindo três repetições de 18 frutos. A inoculação foi efetuada pelo ferimento na região equatorial do fruto, com auxílio de um prego em 3 mm de diâmetro e 4 mm de profundidade, em dois pontos equidistantes. Inoculou-se em cada lesão 10 μL de uma suspensão de 1 x 106 conídios mL-1 de P. digitatum,
permanecendo os frutos em repouso, por aproximadamente uma hora, para que a suspensão fosse absorvida. Em seguida, os frutos foram tratados, de acordo com cada tratamento, conforme descrito anteriormente, secos em temperatura ambiente e armazenados em temperatura de 10 ºC e umidade relativa de 90%±5.
As avaliações fitopatológicas foram realizadas diariamente, a partir do 4º dia após inoculação, durante sete dias. Avaliações de severidade dos frutos foram realizadas pelas medições dos diâmetros das lesões causadas por P. digitatum, com auxílio de um paquímetro digital. Os resultados foram convertidos em severidade pelo cálculo da porcentagem do comprimento do fruto lesionado.
Com os dados obtidos foi calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) pela fórmula proposta por Shaner & Finney (1977): Σ [(Yi + 1 +
Yi)/2] [Xi + 1 - Xi]; em que Yi é o diâmetro da lesão no tempo Xi, e Yi+1 é o diâmetro da lesão
em Xi+1. O tempo foi definido em dias, sendo o valor inicial (Xi) o valor da primeira avaliação.
O experimento foi repetido duas vezes, utilizando o mesmo lote de laranjas.
3.2. Avaliação da qualidade dos frutos
Nas análises físico-químicas, os frutos (três repetições de 72 frutos por tratamento) foram tratados, conforme descrito, sem serem inoculados, e armazenados em caixas de papelão por 28 dias em temperatura de 10 ºC e umidade relativa de 90%±5. Em cada análise oito frutos por tratamento foram coletados e analisados destrutivamente. Análises de cada tratamento foram realizadas no 14º e 28º dia de armazenamento. Uma análise foi realizada no momento de chegada dos frutos, oito frutos foram coletados e analisados, a fim de representar todo o lote.
Para avaliar a firmeza da polpa, foi retirada uma parcela da casca, até atingir o albedo, em dois pontos de três frutos. Com auxílio de um penetrômetro, foi testada a resistência de penetração do fruto. Na análise de cor da casca, foi utilizado o colorímetro Minolta CR310 Data Processor DP301, analisando três pontos de cada um dos cinco frutos. Os mesmos cinco frutos foram pesados e o suco de cada fruto foi extraído, pesado e calculado o rendimento. Do suco extraído avaliou-se o total de sólidos solúveis (ºBrix) com um refratrômetro. Vinte e cinco mililitros de suco foram dispensados em 100 mL de água destilada para avaliação da acidez, por meio da titulação com NaOH 0,3125 N até o ponto de viragem, utilizando o indicador fenolftaleína. Os experimentos foram repetidos duas vezes, utilizando dois diferentes lotes de frutos.
As avaliações de incidência natural de doenças em pós-colheita foram realizadas nos 56 frutos armazenados restantes de cada tratamento das análises físico- químicas. Foi avaliada a porcentagem total de frutos com podridões, após 28 dias de armazenamento.
A avaliação de perda de peso dos frutos, foi realizada com três repetições de 10 frutos tratados e armazenados conforme descrito. Os frutos pesados imediatamente após secagem, no 14º e 28º dia de armazenamento. Foi calculada a
porcentagem de peso perdido em cada avaliação comparado a primeira pesagem. Este ensaio foi repetido uma vez.
3.3. Controle de Penicillium digitatum com agentes de biocontrole e tratamento térmico em armazenamento a temperatura de 20ºC
O trabalho foi composto por 12 tratamentos, em blocos casualizados, sendo combinado em esquema fatorial 2 x 6, sendo realizado ou não do tratamento térmico associado a utilizando os seguintes tratamentos: 1) Testemunha tratada com água, 2) Fungicida tiabendazol, 3) Bacillus subtilis (1,6 x 108 UFC mL-1), 4) Bacillus licheniformis (1,6 x 108 UFC mL-1), 5) Bacillus subtilis – Serenade® (1 x 106 UFC mL-1), 6) Sporidiobolus
pararoseus (1 x 108 células mL-1), 7) Testemunha com tratamento térmico, 8) Fungicida
tiabendazol + tratamento térmico, 9) Bacillus subtilis (1,6 x 108 UFC mL-1) + tratamento térmico, 10) Bacillus licheniformis (1,6 x 108 UFC mL-1) + tratamento térmico, 11) Bacillus
subtilis – Serenade® (1 x 106 UFC mL-1) + tratamento térmico, e 12) Sporidiobolus
pararoseus (1 x 108 células mL-1) + tratamento térmico.
O experimento seguiu a mesma metodologia de inoculação de P.
digitatum, já descrita. No entanto, foram utilizados para cada tratamento três repetições de
cinco frutos, sendo os tratamentos realizados duas horas após a inoculação. O tratamento seguiu a mesma metodologia descrita anteriormente, com exceção do fungicida que foi utilizada outro produto (tiabendazol – 485 g i.a. 100 L-1), e para o tratamento com o agente de biocontrole Sporidiobolus pararoseus, onde os frutos foram tratados através da agitação por 30 segundos na suspensão contendo o agente de biocontrole (MATTOS, 2010). No tratamento
Sporidiobolus pararoseus + tratamento térmico, os frutos foram imersos na água a 52 ºC por 2
minutos, resfriados e depois agitados por 30 segundos na suspensão contendo a levedura. Os frutos foram incubados a 20 ºC e UR de 90%. Após três dias avaliou-se, por um período de cinco dias, o diâmetro das lesões. As avaliações e obtenção da AACPD seguiram a metodologia já descrita. O ensaio foi repetido duas vezes, com dois lotes diferentes de frutos. No segundo lote os frutos estavam em estágio avançado de maturação.
Com a hipótese de que a lavagem de resfriamento, após o tratamento térmico associado com os isolados de Bacillus, pudesse remover o tratamento, mais dois
ensaios foram realizados, usando o mesmo delineamento e tratamentos, exceto pela exclusão do tratamento com Sporidiobolus pararoseus e S. pararoseus + tratamento térmico. Porém, nesses ensaios, todos os tratamentos utilizando o tratamento térmico, os frutos foram tratados com a água quente a 52 ºC por 2 minutos, seguindo o resfriamento por 2 minutos, e só então realizado a imersão dos frutos em suspensão contendo os agentes de biocontrole ou o fungicida tiabendazol. Para os dois ensaios utilizou-se o mesmo lote de frutos, em estágio avançado de maturação, sendo armazenados a 20 ºC e UR de 90%. Após três dias, com o surgimento dos sintomas, iniciaram as avaliações conforme já descritas por um período de cinco dias.
3.4. Análise estatística
Os dados obtidos nos experimentos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade, considerando blocos em esquema fatorial (2x5 ou 2X6).