26 2- Material e Métodos
2.1- Reagentes, solventes e padrões analíticos
Para o desenvolvimento dos diferentes procedimentos analíticos estudados, utilizaram-se diversos solventes, reagentes e padrões analíticos. Os solventes metanol gradient grade, acetonitrilo (ACN), acetato de etilo, ácido fórmico e amónia (25%) foram adquiridos à Merck (Darmstadt, Alemanha), a água ultrapura foi obtida a partir de um equipamento Milli Q, da Millipore (Molsheim, França) e o formato de amónia (99%) foi adquirido à Thermo Fisher Scientific (Waltham, EUA). O reagente de derivatização utilizado foi o BSTFA com 1% de TMCS, adquirido à Supelco (Bellefonte, EUA). Relativamente aos padrões analíticos utilizados, o ácido γ – hidroxibutírico (GHB) e o ácido γ – hidroxibutírico deuterado (GHB-D6) foram adquiridos à Lipomed (Arlesheim, Suiça), o ácido γ-
aminobutírico (GABA) foi obtido à ChromaDex (Irvine, EUA), ao passo que o ácido γ- hidroxibutírico glucuronizado (GHB-GLUC) e o ácido γ-hidroxibutírico glucuronizado deuterado (GHB-GLUC-D4) foram cedidos por Petersen et al. (69). Partindo dos padrões
analíticos em pó, ou seja, os padrões do GHB-GLUC, do GHB-GLUC-D4 e do GABA,
prepararam-se soluções-stock em metanol, a concentrações de 1 mg/mL. Posteriormente, prepararam-se soluções de trabalho de 1 mg/L e de 10 mg/L em metanol. Todas as soluções foram armazenadas e mantidas a -20ºC, como descrito na literatura (25,70).
Para os procedimentos extrativos prepararam-se diferentes misturas de solventes, entre as quais uma mistura metanol/ ácido fórmico em acetonitrilo a 0,1% (10/90, v/v); uma mistura água/metanol/NH4OH (94,5/5/0,5, %/%/%); uma mistura metanol/ NH4OH (2%)
(95/5, %/%) e, também, uma mistura de metanol/acetonitrilo/2 mM de formato de amónia contendo 8% de ACN. Para esta mistura, mediu-se 0,0633g de formato de amónia e diluiu- se em 46 mL água ultrapura e 4 mL de acetonitrilo, de forma a se obter uma solução a 2 mM de formato de amónia contendo 8% de ACN; a esta solução adicionaram-se 25 mL de metanol e 25 mL de ACN.
2.2- Sistema de GC-MS/MS
O equipamento de GC-MS/MS utilizado foi um cromatógrafo Bruker 450-GC (Bruker, Bremen, Alemanha), equipado com um injetor automático e uma coluna capilar
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J&W 5-MS (Agilent, Santa Clara, EUA), acoplado a um Espetrómetro de Massa com um analisador de massas do tipo triplo quadrupolo Bruker 300-MS (Bruker, Bremen, Alemanha). A temperatura do GC foi ajustada, inicialmente, a 60ºC por 2 minutos, aumentou-se para 120ºC a uma velocidade de 10ºC/min, depois aumentou-se para 300ºC a 30ºC/min com 6 minutos de espera final, levando a 20 minutos de tempo total de corrida. As temperaturas do injetor, da linha de transferência e da fonte de ionização foram 250ºC, 280ºC e 260ºC. O gás de arrasto utilizado foi o Hélio BIP (He), a um fluxo de 1 mL/min e a injeção de 2 µL de amostra foi realizada em modo spitless.
2.3- Desenvolvimento do método analítico
Para a avaliação dos diferentes parâmetros da validação do método analítico o ideal seria recorrer a amostras controlo de sangue, ou seja, amostras de sangue sem os analitos que se pretendem estudar. No entanto, dado o caráter endógeno dos analitos em estudo, o GHB-GLUC e o GABA, optou-se por se utilizar água como amostra controlo. Têm-se, como exceção, a validação do procedimento extrativo e o rendimento da extração, onde não se recorreu à agua como controlo, tendo-se utilizado sangue.
2.3.1- Procedimento extrativo
Para a validação do procedimento extrativo testaram-se diferentes solventes para a extração líquido-líquido (LLE) e um outro procedimento extrativo por extração em fase sólida (SPE). No que diz respeito ao único procedimento em fase sólida (SPE), optou-se por se adaptar o protocolo descrito por Richard et al. (67), para a extração de GHB, GABA, 1,4- BD e GBL, no caso aplicado a diferentes tecidos animais.
Neste trabalho, o procedimento de SPE foi aplicado a amostras controlo de sangue, bem como a amostras desse mesmo sangue fortificado com GHB, GHB-GLUC e GABA. Este procedimento foi desenvolvido utilizando colunas OASIS® MCX, fornecidas pela WATERSTM (Waters Corporation, Milford, EUA). No procedimento testado, inicialmente 200 μL de amostra foram diluídos em 1 mL de tampão fosfato (KH2PO4, 0,1 M). Procedeu-
se ao condicionamento da coluna com 2 mL de metanol e, posteriormente, equilibrou-se a coluna com o mesmo volume de água, seguindo-se a introdução das amostras na coluna. De
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seguida, adicionou-se 1 mL de uma mistura previamente preparada de metanol/ácido fórmico em acetonitrilo (10/90, v/v), sendo o objetivo deste passo a eluição dos compostos acídicos, nomeadamente do GHB e, possivelmente o GHB-GLUC. Após eluição, realizou- se lavagem da coluna com 2 mL de água e 2 mL de água/metanol/NH4OH (94,5/5/0,5,
%/%/%). Seguiu-se a eluição dos compostos básicos, como é o caso do GABA, com a adição de 2 mL de metanol/NHOH (2%) (95:5, %/%). Os tubos de vidro com os eluatos foram secos e concentrados, pela evaporação dos eluentes, em evaporador rotativo (Centrivap, Labconco), durante uma hora a 45ºC, sob vácuo. Seguiu-se o procedimento de derivatização descrito abaixo na secção 2.4. com posterior transferência dos extratos para inserts de reação dento de vials.
Para o procedimento extrativo de precipitação proteica com metanol, adicionaram-se 100 μL de amostra controlo de sangue a um eppendorf de 1,5 mL, seguidos da adição de 10 μL solução de padrão interno (GHB-D6) a 1 mg/L e de 200 μL de metanol. De seguida
agitou-se, no vórtex, durante cerca de 30 segundos, com sucessiva centrifugação a 4000 RPM, durante 15 minutos. Findo o tempo da centrifugação retirou-se o sobrenadante para um vial, seguindo o procedimento de preparação de amostras descrito abaixo. Os restantes procedimentos LLE foram semelhantes ao descrito anteriormente para a precipitação proteica com metanol, alterando apenas o solvente utilizado. Testaram-se, como solventes, o acetato de etilo, o acetonitrilo e, também, a mistura metanol:acetonitrilo:formato de amónia 2 mM (25:25:50), adaptada de Wang et al. (70).
2.4- Preparação das amostras
Após se proceder à extração, colocaram-se os eluatos num evaporador de azoto (Turbovap® LV, Biotage, Uppsala, Suécia) até secagem completa. Seguiu-se o processo de derivatização química, que envolveu a adição de 50 μL de reagente de derivatização (BSTFA+TMCS, 99:1), com posterior aquecimento a 65ºC num bloco de aquecimento (MULTI-BLOK® Heater, Lab-Line, Mumbai, Índia), em banho seco. Findos 30 minutos, retiraram-se os vials do banho seco, ficando o extrato preparado para a análise instrumental.
Antes de se proceder à validação do método analítico, prepararam-se curvas de calibração de amostras controlo negativas (água) fortificadas com os analitos de interesse
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(GHB-GLUC, GABA e padrão interno). Após derivatização, procedeu-se à injeção das mesmas no espetrómetro de massa. Realizou-se, também, o congelamento das amostras a - 20ºC, tendo-se voltado a injetar cada uma das curvas após descongelamento, para comparação dos resultados obtidos pré e pós congelamento. Esses passos de pré-validação tiveram como objetivo a avaliação do comportamento dos analitos, nomeadamente a linearidade, assim como a avaliação da estabilidade dos mesmos à congelação.
2.5- Análise de amostras reais e análise estatística
Após a validação do método analítico pretendeu-se quantificar os compostos em estudo, inclusive o GHB, em amostras reais. Para tal aplicou-se o procedimento descrito anteriormente, preparando-se uma curva de calibração para, posteriormente, se quantificarem as amostras reais.
Procedeu-se ao estudo de uma amostra de soro positiva para GHB, à única amostra, até à data, com deteção positiva para GHB, disponível a nível nacional. Foram ainda estudadas amostras de sangue periférico post-mortem de 9 amostras com data e hora de óbito conhecidas. Estas amostras, para cada processo, foram colhidas em dois momentos diferentes, tendo uma das colheitas sido realizada aquando da admissão do cadáver e outra no momento da autópsia.
Os resultados experimentais são apresentados em termos de média ± desvio padrão. A verificação de eventuais diferenças entre as concentrações de GHB (ng/mL) entre géneros, na primeira e na segunda colheita, foi realizada com recurso ao teste não paramétrico Mann- Whitney. Para a comparação entre as concentrações do composto em estudo dos indivíduos com idade superior a 50 anos e dos indivíduos com idade inferior a 50 anos, realizou-se um t-test não emparelhado, para cada uma das colheitas. A comparação entre a concentração de composto obtida na primeira e na segunda colheita foi efetuada com recurso a um t-test emparelhado. A análise estatística foi realizada com recurso ao software PRISM ® GraphPad 7 (La Jolla, EUA) para o Windows. Para se detetar possíveis associações entre as concentrações sanguíneas de GHB e o PMI, calculou-se o coeficiente de Pearson (r), recorrendo à função PEARSON do programa informático Excel ® (Microsoft, Redmond, EUA).