EFICIÊNCIA DE SELEÇÃO PARA ALTO TEOR DE PROTEÍNA EM FEIJÃO
MATERIAL E MÉTODOS
Material genético
Foram utilizadas quatro cultivares de feijoeiro com alto teor de proteína: PVA 109, Gaurama, Baliza e Laranja como fontes doadoras da característica alto teor de proteína com o objetivo de incorporar alelos para essa característica na linhagem CNFC-7827 da Embrapa Arroz e Feijão.
O cultivar PVA 109 possui grão vermelho com venações beges e teor de proteína de aproximadamente 24% em suas sementes. Os genitores Gaurama e Baliza possuem grão do tipo preto e foram desenvolvidos pelo CEFET - Pato Branco – PR, recomendados para o Paraná e Santa Catarina. Possuem teor de proteína de, aproximadamente, 25 e 23%, respectivamente. O cultivar Laranja, também desenvolvido pelo CEFET possui grão do tipo carioca, com halo laranja em torno do hilo. Possui teor de proteína nas sementes de aproximadamente 29%. O genitor recorrente (CNFC 7827) é uma linhagem do tipo carioca, desenvolvida pela Embrapa Arroz e Feijão, possui crescimento indeterminado tipo III. Possui alto potencial produtivo, ciclo normal de 90 dias com florescimento em torno de 42 dias após a germinação e teor de proteína de 22,98%.
Foram efetuados cruzamentos entre o genitor recorrente e os doadores, obtendo-se as sementes F1. Todas as combinações híbridas foram
autofecundadas para obter as sementes F2 (populações segregantes). Estas
etapas foram realizadas na Embrapa – Arroz e Feijão. Foram analisadas 400 sementes segregantes obtidas de cada população. As sementes F2 foram
analisadas individualmente pelo método de análise não destrutiva para concentração de proteína, que utiliza o ácido bicinconínico (BCA) (SMITH et al., 1985), adaptado para análises de proteína em sementes de feijão. Com a finalidade de selecionar os genótipos F2 com maiores teores de proteína foi
utilizada uma pressão de seleção de aproximadamente 10%. Com isso, em torno de 40 sementes F2 foram selecionadas e semeadas em casa de
vegetação obtendo-se plantas F2. Posteriormente foi extraído o DNA destas
plantas para análises com marcadores RAPD (fingerprinting). Em seguida, foram escolhidas as plantas geneticamente mais próximas do genitor recorrente e realizado o primeiro retrocruzamento, obtendo-se assim as progênies RC1F1.
As sementes F2:3 foram avaliadas para confirmar a concentração de
proteína das plantas selecionadas pelo método Kjeldahl.
Análise da concentração de proteína
A concentração de proteína das sementes individuais F2 foi determinada
pelo método do ácido bicinconínico (BCA) (SMITH et al., 1985), com pequenas modificações. De cada semente, foram tomados 10 mg de tecido do cotilédone, no lado oposto ao eixo embrionário. A porção cortada das sementes foi macerada em gral, na presença de 2 mL de SDS (Sodium Duodecil Sulfato) 1%. Depois de homogeneizada, esta solução foi diluída 300 vezes e três alíquotas de 100 μL de cada tubo foram transferidas para placas de ELISA (triplicatas). A seguir, foram adicionados 200 μL de solução de ácido bicinconínico contendo 2% de sulfato de cobre. Em cada placa, foram aplicadas também as quantidades crescentes e conhecidas 4, 8, 10 e 15 μg de BSA (albumina sérica bovina), a fim de estabelecer uma curva padrão que permitisse calcular a concentração de proteína das amostras. As placas foram colocadas em banho- maria à 37oC, por 30 minutos, e após esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos, foram feitas as leituras em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 560 nm. A concentração de proteínas foi expressa em porcentagem, constituindo a média das triplicatas.
Determinação da concentração de proteína na geração F3 ( Kjeldahl)
Para confirmar a concentração de proteínas das sementes selecionadas, foram analisadas 10 sementes F2:3 geradas de cada semente F2 selecionada.
Neste caso, a determinação de proteínas foi efetuada pelo método Kjeldahl para a quantificação de nitrogênio total descrito pela AOAC (1975), com modificações. Na fase de digestão, após obtenção do material digerido, adicionou-se peróxido de hidrogênio 30%, levando a mistura ao aquecimento por mais 30 minutos. Na fase de destilação, recolheu-se a amônia liberada em solução de ácido bórico 4%. Obteve-se o teor de nitrogênio pela titulação da amônia com ácido clorídrico 0,05 N. A partir do teor de nitrogênio, foi calculada a porcentagem de proteína total da amostra, empregando-se o fator 6,25. Os resultados das concentrações de proteína foram expressos em porcentagem com base na matéria seca, constituindo a média de duas repetições.
Análises genéticas
Foi estimada a herdabilidade do caráter teor de proteínas para cada uma das quatro populações F2. Para isto, foi necessário estimar as variâncias
fenotípicas, genotípicas e ambientais.
Variâncias fenotípica, genotípica e ambiental nas populações F2
Variância fenotípica
Estimada usando-se os valores fenotípicos obtidos nas populações F2,
obtida pelo uso da seguinte expressão:
(
)
∑
− −=
σˆ2 Xi X2 n 1
em que
2
ˆF
σ
= variância fenotípica estimada;X = dados fenotípicos das características avaliadas em cada planta; X = média dos caracteres avaliados; e
n = número de plantas avaliadas.
Variância ambiental
Estimada pela média ponderada das variâncias dos pais:
2 1 2 2 2 1 2 1 2 ˆ n n p n p n E + + =
σ
σ
σ
em que 2 ˆEσ
= variância ambiental estimada;2 2 2
1 ˆ
ˆP e
σ
Pσ
= variâncias fenotípicas estimadas dos genitores 1 e 2, respectivamente; en1 e n2 = número de plantas dos genitores 1 e 2, respectivamente.
Variância genotípica
Estimada pela diferença entre as estimativas da variância fenotípica e da variância ambiental, ou seja:
2 2 2
ˆG
σ
Fσ
EHerdabilidade nas populações F2
As herdabilidades no sentido amplo foram estimadas segundo a expressão abaixo: 2 2 2 ˆ ˆ F G a h
σ
σ
= em que 2 ah = estimativa da herdabilidade no sentido amplo;
2
ˆG
σ
= estimador da variância genotípica na população F2; e2
ˆF
σ
= estimador da variância fenotípica na população F2.Ganhos de seleção (%)
Os ganhos de seleção (%) no teor protéico em relação ao genitor recorrente foram obtidos considerando-se todas as famílias F2:3 (GS%) e
também considerando apenas as cinco progênies F2:3 de maior teor protéico
(GS5%). Para tal, foram utilizadas as seguintes expressões:
GS (%) = MP 100 MPx 3 MF − GS5 (%) = MP 100 MPx 3 F 5 M − onde:
MF3 representa o teor protéico médio das famílias F2:3, derivadas das
sementes F2 selecionadas pelo método do BCA;
M5F3 representa o teor protéico médio das 5 famílias F2:3 de maior teor
protéico;
Avaliação da eficiência da seleção para alto teor de proteína em F2, pelo
método do ácido bicinconínico (BCA)
Para avaliar a eficiência da seleção para teor de proteína em populações F2 por método de análise não destrutiva em feijoeiro, foram plantadas 100
sementes F2, não selecionadas pelo BCA, do cruzamento Laranja x CNFC
7827, para fins de comparação de suas médias de concentração de proteína em F3 com as médias das plantas selecionadas deste cruzamento (15 plantas
originadas de sementes F2 selecionadas). Estas plantas cresceram sob as
mesmas condições ambientais e tiveram suas sementes avaliadas pelo método Kjeldahl. Foi calculada a herdabilidade em F3 para esta população. Foram
efetuadas simulações de ganho de seleção na população não selecionada segundo as fórmulas de ganho de seleção apresentadas acima. Foram simuladas seleções de 20, 10 e 5 indivíduos para calcular os prováveis ganhos de seleção.