Para permitir o desenvolvimento de cultivos livres de contaminantes e o estabelecimento e desenvolvimento in vitro de Eugenia involucrata, foram realizados dois experimentos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, do Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, Rio Grande do Sul.
No primeiro experimento, foram utilizadas como doadoras de explantes espécimes de cerejeira cultivados em casa de vegetação. As plantas foram mantidas em vasos plásticos com 22 cm de altura e 24 cm de diâmetro (capacidade para aproximadamente 8 L) contendo o substrato Plantmax®. Estas apresentavam aproximadamente dois anos de idade e permaneceram cobertas com sombrite a 50% sendo que, em épocas de maior calor, instalou-se sobre o sombrite uma manta de tecido-não-tecido (TNT) branco. Além de irrigações diárias, as plantas receberam, mensalmente, 400 ml de solução de nitrogênio, fósforo e potássio (N-P-K: 5-20-20) a 1 g L-1 e, a cada 15 dias, 400 ml de solução a 1 g L-1 de nitrogênio (uréia). Pulverizações quinzenais foram realizadas com solução a base de Cercobin700PM® (thiophanato metílico) a 1 g L-1 e sulfato de estreptomicina a 0,1 g L-1, visando obter um pré-tratamento para a posterior desinfestação dos explantes.
Neste experimento, foram utilizados como explantes segmentos nodais de ramos que não fossem extremamente lenhosos (embora apresentassem aspecto semi-lenhoso), os quais possuíam, aproximadamente, 15 cm de comprimento e de quatro a cinco segmentos nodais. Para homogeneizar os explantes, foram excluídos os segmentos apical e basal do ramo. Realizou-se, com tesoura, o corte dos ramos e de meia folha destes. Após, foram imersos em água destilada contendo 1 g L-1 do fungicida Benlate 500® (benomyl) e 0,1 g L-1 de sulfato de estreptomicina. Em laboratório, os explantes foram lavados com o auxílio de água corrente, esponja e detergente comercial. Neste momento também foram seccionados os segmentos, os quais permaneceram imersos em água destilada até a desinfestação.
Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram expostos por 30 segundos à solução de etanol a 70% (v/v), seguido de um enxágue com água estéril. Posteriormente, foram imersos em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 1,5% (v/v), contendo três gotas de detergente comercial, permanecendo sob agitação por 0, 5, 10, 15, 20 e 25 minutos. A concentração de NaOCl foi escolhida com base em testes realizados previamente. A seguir, foi realizado um triplo enxágue e os explantes permaneceram em água estéril durante o procedimento de inoculação. A unidade experimental foi composta por um frasco com capacidade de 150 ml, contendo 30 ml de meio nutritivo e três explantes. O meio utilizado foi o MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) acrescido de 30 g L-1 de sacarose, 0,1 g L-1 de mio-inositol e 7 g L-1 de ágar. Desta forma, conduziu-se o experimento em delineamento inteiramente casualizado, com seis tratamentos e 10 repetições, em um total de 60 parcelas e 180 explantes introduzidos.
Para a introdução in vitro, realizou-se a remoção dos resquícios foliares existentes e, também, seccionaram-se os segmentos a 0,3 cm acima da região nodal e 0,8 cm abaixo desta. O corte da parte basal foi realizado em bisel, visando aumentar a superfície de contato com o meio e facilitar a introdução. Cada explante possuía duas gemas dormentes.
Aos 21 dias de cultivo, foram avaliadas as variáveis: contaminação geral (sendo a ocorrência de contaminantes junto aos explantes, independentemente do microrganismo causador); contaminação bacteriana (presença de colônias bacterianas junto aos explantes); contaminação fúngica (contaminações compostas por micélios fúngicos junto aos explantes); oxidação fenólica (escurecimento dos explantes); todas expressas em porcentagem.
No segundo experimento, as plantas, que apresentavam aproximadamente três anos de idade, permaneceram em casa de vegetação, inicialmente, sob as mesmas condições descritas anteriormente. No entanto, quatro semanas precedentes à coleta dos explantes, realizou-se uma poda em toda a parte aérea das plantas. As podas foram realizadas deixando-se regiões de galhos e ramos com duas ou mais gemas visíveis.
Após a poda, os tratos culturais foram efetuados da mesma forma relatada no experimento anterior, contudo, foi intensificado o uso da solução de nitrogênio (uréia), à qual foi adicionado potássio na proporção de 2:1, efetuando-se uma aplicação semanal. Além disso, os tratos sanitários foram administrados a cada sete dias, encharcando-se os ramos por completo.
Para a coleta dos explantes, foram escolhidos ramos jovens, verdes, possuindo entre dois e três segmentos, considerando-se o apical e o(s) nodal(is). Os segmentos foram imersos em solução contendo Benlate500® (benomyl) a 1 g L-1 e sulfato de estreptomicina a 0,1 g L-1
, durante 30 minutos. Em Laboratório, foram cuidadosamente lavados em água corrente, com o auxílio de esponja e detergente comercial, e seccionados com o uso de uma tesoura. Após, permaneceram por 30 minutos em solução de etanol a 70% (v/v), seguido de um enxágue em água estéril. A seguir, em capela de exaustão, os explantes foram imersos em solução de bicloreto de mercúrio (HgCl2) a 0,05% (p/v), onde permaneceram por 10 minutos. Posteriormente, foram enxaguados com água estéril e, em câmara de fluxo laminar, foram expostos à agitação por 15 minutos em solução de NaOCl a 1,5% (v/v)
acrescida de três gotas de detergente comercial. Passado este período, as plantas foram enxaguadas três vezes e permaneceram, durante a
inoculação, em água estéril contendo 100 mg L-1 de ácido ascórbico. Os explantes foram compostos por segmentos apicais (região apical dos ramos), seccionados em bisel a 0,8 cm do nó e contendo uma gema dormente; e segmentos nodais, os quais tiveram seus pares de folhas laterais retirados, deixando-se apenas o vestígio inicial do limbo, e cortados a 0,3 cm acima e 0,8 cm abaixo da região do nó, a qual possuía duas gemas dormentes. O corte da região basal foi realizado em bisel.
Este experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, utilizando-se um esquema bifatorial 2 x 3 onde, os níveis do fator “A”, referem-se a dois tipos de explantes (segmentos apicais e segmentos nodais) e, os níveis do fator “B” , a três meios nutritivos. Os meios utilizados foram o MS (MURASHIGE; SKOOG,
1962), ½ MS (composto pela diluição do meio MS à metade de sua concentração normal de sais) e WPM – Wood Plant Medium (LLOYD; MCCOWN, 1981). O ensaio apresentou 10 repetições, cada uma composta por um frasco com capacidade para 150 ml contendo 30 ml de meio nutritivo e dois explantes, contabilizando 60 unidades experimentais e 120 explantes inoculados. Os frascos foram fechados com papel alumínio. A composição dos meios nutritivos MS, ½ MS e WPM pode ser visualizada na Tabela 1. Aos meios foram acrescidos 30 g L-1 de sacarose, 0,1 g L-1 de mio-inositol e 7 g L-1 de ágar.
Tabela 1 – Composição dos meios nutritivos MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), ½ MS e WPM (LLOYD; MCCOWN, 1981)* MS (mg L-1) ½ MS (mg L-1) WPM (mg L-1) Macronutrientes Ca(NO3)2.4H2O - - 556,000 NH4NO3 1.650,000 825,000 400,000 KNO3 1.900,000 959,000 - CaCl2.2H2O 440,000 220,000 96,000 MgSO4.7H2O 370,000 185,000 370,000 KH2PO4 170,000 85,000 170,000 K2SO4 - - 990,000 Micronutrientes MnSO4.4H2O 22,300 11,150 22,300 ZnSO4.7H2O 8,600 4,300 8,600 H3BO3 6,200 3,100 6,200 KI 0,830 0,415 - Na2MoO4.2H2O 0,250 0,125 0,250 CuSO4.5H2O 0,025 0,012 0,250 CoCl2.6H2O 0,025 0,012 - Ferro-EDTA Na2EDTA 37,250 18,620 37,250 FeSO4.7H2O 27,850 13,925 27,850 Vitaminas Tiamina-HCl 0,100 0,050 1,000 Piridoxina- HCl 0,500 0,250 0,500 Ác. Nicotínico 0,500 0,250 0,500 Glicina 2,000 1,000 2,000 Mio-inositol 100,000 100,000 100,000
*Dados adaptados de Xavier et al. (2009).
Durante os primeiros 30 dias de cultivo, os explantes permaneceram nos meios nutritivos citados, aos quais foi acrescido 1 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e 5 µM de tidhiazuron (TDZ). Após este período, os explantes foram
subcultivados por mais 30 dias nos respectivos meios nutritivos, porém, na ausência de reguladores de crescimento e com o acréscimo de 1 g L-1 de carvão ativado.
Aos 60 dias, foram avaliadas as variáveis: contaminação geral (%), contaminação fúngica (%) e contaminação bacteriana (%) (seguindo-se os mesmos critérios descritos no experimento anterior). Adicionalmente, avaliaram-se as variáveis: oxidação fenólica (visualizada pela coloração do explante, mesmo quando o aspecto oxidativo não inibiu o seu desenvolvimento), média de brotos por explantes (considerando-se como broto qualquer desenvolvimento das gemas do explante), média de brotos desenvolvidos por explante (considerando-se como brotos apenas àqueles desenvolvidos e que haviam emitido folhas), média de folhas emitidas por explante, porcentagem de enraizamento, intumescimento dos explantes, porcentagem de calos na base dos explantes e, por fim, estabelecimento
in vitro (porcentagem de explantes verdes, vivos, que apresentaram qualquer
aspecto de desenvolvimento).
Em ambos os experimentos, para a vedação dos frascos, foi utilizado papel alumínio. O pH dos meios foi ajustado para 5,8 antes da inclusão do ágar e após a inclusão dos reguladores de crescimento ou carvão ativado. Os meios de cultura foram autoclavados por 20 minutos a 121°C e 1,5 atm de pressão. As unidades experimentais foram dispostas em sala de cultivo com temperatura controlada de 25+3°C e intensidade luminosa de 20 µmol m-2 s-1, obtida por meio de lâmpadas fluorescentes brancas frias. O fotoperíodo foi regulado para 16 horas.
Após testar a normalidade dos dados por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov e a homogeneidade de variâncias pelo teste de Bartlett, estes foram transformados pela função x+0,5 e submetidos à análise de variância. Quando o valor de “F” foi significativo, dados de tratamentos quantitativos foram submetidos à análise de regressão polinomial e, dados de tratamentos qualitativos, à comparação de médias por meio do teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro. Os resultados apresentados são as médias originais obtidas e os modelos matemáticos também apresentam os valores não transformados. O programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000) foi utilizado para o processamento dos dados.