4.1- Animais e protocolo de cultura de órgão inteiro (próstata)
Foram utilizados 90 ratos Wistar machos recém-nascidos (dia 0) provenientes do cruzamento de matrizes da REBIR- UFU. Os filhotes foram decapitados no dia do nascimento e suas próstatas ventrais dissecadas com auxílio de microscópio estereoscópio. Toda a próstata ventral e sua inserção na uretra foi cultivada por 3 dias em membranas PTFE (Millipore) flutuando sob 500 μl de meio basal constituído de DMEM/l de meio basal constituído de DMEM/ Ham’s F-12 (1:1; vol:vol) suplementado com insulina-transferrina-selênio (Gibco) e 10 nM de cipionato de testosterona (Novaquímica), de acordo com o método descrito por Lopes et al., 1996. As culturas foram divididas em 3 grupos: Controle - próstatas tratadas com meio basal acima descrito, contendo glicose a 100 mg/dL (5.5 mM); Glicose
moderada - culturas tratadas com 225 mg/dL de glicose (7 mM) e Alta glicose- tratadas
com 450 mg/dl de glicose (25 mM). Os meios foram renovados a cada 24 horas e as próstatas incubadas durante 1, 2 e 3 dias nos meios descritos. Para cada ensaio, as próstatas foram fotografadas em microscópio invertido acoplado a um sistema de captura de imagens em 1, 2 e 3 dias de cultura. A área de toda a próstata foi demarcada usando o software Image Pro Plus para a determinação da área da glândula. Os animais foram tratados de acordo com as normas previstas no Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e o projeto tem aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA-UFU) sob o parecer 110/16.
4.2- Processamento das próstatas para análise histológica
Após o período de cultura, as próstatas foram fixadas em Bouin por 3 horas em geladeira, lavadas em água, desidratadas por imersão em álcool e clarificadas em xilol para processamento de rotina histológica em parafina. Cortes histológicos seriados de 4 μl de meio basal constituído de DMEM/m de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo (Leica) e separados para coloração por Hematoxilina de Harris e eosina (H&E), para avaliação geral do tecido glandular, ou pela técnica picrosírius, para caracterização da deposição de colágeno no compartimento estromal. Os cortes foram analisados e fotografados em fotomicroscópio (Leica, DM500) acoplado em sistema de aquisição de imagens pelas objetivas de 10X e 40X.
A contagem do número de brotos prostáticos foi feita a partir de imagens digitalizadas (objetiva de 10X) dos cortes histológicos corados em H&E. A contagem de figuras mitóticas foi feita por meio de imagens digitalizadas a partir de objetiva de 40X de cortes histológicos.
A distribuição de colágeno foi determinada por meio de análise estereológica. Tal análise foi efetuada em cortes histológicos submetidos à coloração de Picrosirius. Foram utilizados campos microscópicos em objetiva 40X e a porcentagem de fibras colágenas em cada campo foi determinada após a aplicação do retículo demarcado e contagem dos pontos que tocassem a área marcada pelo Picrosirius, de acordo com o sistema estereológico de Weibel (Weibel, 1974). Todas as contagens histológicas foram realizadas nas próstatas de 15 animais por grupo (5 animais para cada período experimental).
4.3- Análise imunohistoquímica da proliferação celular e células musculares lisas
Os cortes em parafina foram submetidos a reações imunohistoquímicas para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e alfa-actina de músculo liso. Para isso, os cortes foram imersos em tampão citrato pH 4,0 e aquecidos a 92ºC por 40 minutos em panela de vapor para a recuperação antigênica. O bloqueio da atividade de peroxidase enndógena foi feito por tratamento dos cortes com H2O2 3% em metanol por 15 minutos, seguido do bloqueio das interações inespecíficas de proteínas com Background Sniper (Biocare Medical, Concord, CA, USA) por 15 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados overnight com os anticorpos primários para alfa-actina de músculo liso (Mouse anti-human, sc- 32251, Santa Cruz Biotecnology) ou PCNA (Mouse anti-human, sc- 56, Santa Cruz Biotecnology), diluídos em albumina 1% a 4ºC, lavados em PBST e incubados com anticorpo secundário Universal Link seguido de Stroptoavidina-HRP (Kit Star Trek Universal HRP Detection System- Biocare) por 45 min cada. A revelação foi feita com diaminobenzidina – DAB (EasyPath). Os cortes foram contra- corados com hematoxilina. A frequência relativa de células musculares lisas foi determinada através do sistema de contagem de pontos acima descrito. As células PCNA-positivas foram contadas visualmente nos campos microscópicos digitalizados. Foi utilizado de 5 a 10 campos microscópicos de cada corte histológico, em aumento de 40X, da próstata de 9 animais por grupo (3 animais por tempo experimental).
4.4- Western blotting
Os conteúdos de ERK1/2 (totais e fosforiladas) e de MMP-2, foram avaliados por western blotting nas próstatas cultivadas por 3 dias nos meios de tratamento. Para isso, um pool com próstatas de 3 animais formou cada n amostral, sendo que cada grupo experimental foi formado por 3 amostras (n=3). As amostras foram homogeneizadas em tampão Cell Lysis contendo inibidores de proteases (Protease Inhibitor Cocktail- Sigma Aldrich), centrifugadas a 14000 rpm e o sobrenadante foi coletado para quantificação do conteúdo de proteínas pelo Método de Bradford (BRADFORD, 1976). Posteriormente, alíquotas de 10 μl de meio basal constituído de DMEM/g de proteína separadas em SDS-PAGE 10% e após a eletroforese, transferidas para membrana de nitrocelulose. A ligação inespecífica de proteínas foi bloqueada através da incubação das membranas em albumina 5% em tampão Tris com Tween 20 a 0,2% (TBST) por 60 minutos em temperatura ambiente. As membranas foram subseqüentemente incubadas overnight com os anticorpos primários diluídos 1:1200 em albumina 3% em TBST: pERK (rabbit anti- human, #4370), ERK (rabbit anti-human, #9102), MMP2 (rabbit anti-human, #87809) a alfa tubulina (mouse anti- human, #3873) - Cell Signaling Technology.
Após lavagem, as membranas foram incubadas em anticorpo secundário específico conjugado à peroxidase, diluído 1:35000 em TBST por 1 hora. Os componentes imunorreativos foram revelados pelo kit de detecção quimioluminescente ECL (Pierce Company) e a reação luminosa das bandas foi avaliada em sistema de Análise de gel e membrana (Amersham Imager 600). A quantidade de cada proteína estudada foi determinada através da densitometria das bandas pelo software Image J (versão 1.34; Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Os níveis de proteínas fosforiladas foram normalizados com base na expressão da proteína na sua forma total (fosforilada e não fosforilada). No caso da MMP-2, a normalização das bandas foi realizada com alfa-tubulina.
4.5- Avaliação da morte celular por apoptose
A morte celular por apoptose foi estudada com o uso do kit EnzCheck Caspase-3 Assay (Thermo Fischer) que quantifica os níveis de caspase 3 em sua forma ativa. O conteúdo foi expresso em intensidade de fluorescência normalizada pela concentração de proteínas de cada amostra. Para cada grupo experimental foram utilizadas 3 amostras
(n=3), cada uma contendo um pool de 3 próstatas, que foram homogeneizadas em tampão Cell Lysis de acordo com a metodologia de extração de proteínas mencionada para o western blotting. Para cada amostra 2,5 μl de meio basal constituído de DMEM/L de sobrenadante foram diluídos em 47,5μl de meio basal constituído de DMEM/L de tampão reagente e incubados por 30 minutos e a medida da fluorescência (excitação/emissão 342/441 nm) foi feita em fluorímetro de microplacas.
4.6- Quantificação de TGF-β por ELISA
A forma ativa do TGF-β contida nos extratos de próstatas foi mensurada em 50 μl de meio basal constituído de DMEM/L de sobrenadante por meio do kit Human/Mouse TGF-β1 Uncoated ELISA 88-8350 (InvitrogenTM) de acordo com as instruções do fabricante. As diluições do sobrenadante foram dicionadas à placa de ELISA previamente recoberta com anticorpo monoclonal murino anti- TGF-β1. Então, foi adicionado o anticorpo de detecção biotinilado e, em seguida, o complexo avidina-HRP. Por fim, a placa foi lavada e adicionou-se a solução de revelação – o substrato TMB. A coloração desenvolvida foi interrompida com ácido sulfúrico 1M após 15 min de incubação e a intensidade de cor medida a um comprimento de onda de 450 nm na leitora de microplacas.
4.7- Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada no software Instat (GraphPad Software©), no qual foi performado o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Para amostras que seguiam distribuição normal foi realizado o teste t-Student paramétrico e para as que não seguiam, realizou-se o teste t-Student não paramétrico na avaliação da significância estatística das diferenças entre médias (p<0,05).